Caractérisation des protéines virales impliquées dans la replication et la maturation de l'ARN des virus de la famille des Flaviviridae

Ce projet de recherche vise à caractériser certaines protéines impliquées dans le métabolisme des ARN des virus appartenant à la famille des Flaviviridae. Dans un premier temps, des paramètres de stabilité de l'ARN polymérase du virus de l'hépatite C ont été étudiés. Selon des travaux antérieurs, l'importance du rôle des ions Mg[indice supérieur 2+] ou Mn[indice supérieur 2+] pour l'activité enzymatique de la polymérase virale a été démontré. Afin d'élucider le rôle de ces ions dans l'activité de la protéine ainsi que la changement de conformation due à la liaison des ions en solution, nous avons utilisé la spectroscopie à fluorescence pour évaluer l'interaction entre la protéine et divers ions métalliques. Cette technique, combinés à des essais de dénaturation chimique et thermique, permet de démontrer l'importance des ions métalliques dans la stabilité de la protéine. Nos essais démontrent clairement que la protéine possède une stabilité accrue lorsqu'elle est liée à des ions métalliques. De plus, nos données indiquent que le site actif de la protéine est plus vulnérable aux agents dénaturants que les autres portions de la protéine et des études de mutagenèse ont confirmé l'identité des résidus impliqués dans la liaison du Mg[indice supérieur 2+]. Enfin, l'utilisation de sondes fluorescentes nous permet de démontrer l'apparition de changements conformationnels significatifs suite à la liaison des ions métalliques. Des connaissances approfondies sur la réaction catalysée par l'ARN polymérase du virus de l'hépatite C ainsi qu'une meilleure compréhension des propriétés biochimiques de cette protéine devraient éventuellement mener au développement de stratégies antivirales efficaces. Dans un deuxième temps, une caractérisation de l'activité de la protéine NS3 du virus du Nil occidental a été effectuée afin d'améliorer nos connaissances sur les étapes élémentaires de la réplication de ce virus. La portion carboxy-terminale de la protéine NS3 supporte plusieurs activités: une activité ARN-triphosphatase impliquée dans la synthèse de la structure coiffe ainsi qu'une activité ATPase/hélicase essentielle lors de la réplication de PARN viral. Divers paramètres biochimiques et cinétiques des activités ARN-triphosphatase et ATPase ont été estimés afin de déterminer les conditions optimales, notamment, les besoins en ions métalliques des différentes activités. De plus, une caractérisation approfondie de l'enzyme, qui consiste en la détermination des meilleurs substrats de l'activité hélicase a été effectuée. Nos travaux indiquent que la protéine NS3 du virus du Nil occidental possède une forte processivité et déroule l'ARN double brin des extrémités 3'[flèche vers la droite] 5' et de 5'[flèche vers la droite] 3'. Enfin, les changements conformationnels produits lors de la liaison d'ions métalliques, (en occurence le Mg[indice supérieur 2+]) et les différents substrats de la protéine ont été étudiés, ainsi que l'éventuel effet stabilisateur de leur liaison, et ce en utilisant la spectroscopie à fluorescence et le dichroïsme circulaire. Par ailleurs, les études de caractérisation de la protéine NS3 ont révélé que les activités ARN-triphosphatase et ATPase/hélicase sont inhibées par le tripolyphosphate, une petite molécule qui imite les substrats de la protéine NS3. Le tripolyphosphate pourrait, éventuellement, servir comme modèle pour le développement des agents antiviraux. Cette étude permet de mieux cerner le mode catalytique et le comportement conformationnel en solution des enzymes des virus de la famille de Flaviviridae face aux différents substrats et co-facteurs, pour finalement mieux cibler leur rôle dans la réplication du virus et ainsi développer des stratégies anti-virales