β-Glucosidasas de cepas nativas y su potencial en la liberación de aromas en vinos. Desarrollo de nuevas estrategias para su uso en la industria enológica

Uruguay es un país vitivinícola, productor desde mediados del siglo XVII y ha sido reconocido internacionalmente con premiaciones y distinciones por su excelencia en calidad. Uno de los desafíos para el crecimiento del sector es la producción de vinos con características distintivas, competitivos para el mercado internacional. Actualmente, existe una tendencia a explorar y utilizar el potencial de la microbiota silvestre nativa en el proceso de elaboración de vinos, para aportar atributos que contribuyan a la calidad del producto. Algunos de estos atributos están asociados a productos generados por reacciones enzimáticas, por lo que la búsqueda y estudio de nuevas enzimas con propiedades específicas es muy interesante.Las β-glucosidasas (BGLs) son enzimas capaces de hidrolizar precursores glicosídicos de aromas que permanecen después de finalizada la fermentación y que constituyen una reserva potencial de aroma. Es extremadamente difícil encontrar variantes de estas enzimas que sean activas y estables en las condiciones de estrés enológico, como son las elevadas concentraciones de glucosa del mosto (~100 g/L), etanol en vinos (~12 % v/v), valores de pH ácidos (3.0-4.0), entre otras. En este trabajo, el primer abordaje fue seleccionar cepas nativas no-Saccharomyces de ambientes vínicos (Colección del Laboratorio de Enología de la Facultad de Química) capaces de producir actividad BGL a pH 4.0. Además de la cepa de referencia Issatchenkia terricola 0621, se destacaron en la producción de actividad BGL a este pH, las cepas I. terricola PV10-69F e Issatchenkia orientalis TE11-19F. Considerando que no se habían reportado estudios de caracterización de BGLs de I. orientalis, en esta tesis se purificó y caracterizó dicha enzima. Para su aplicación en vinos, la enzima fue estabilizada mediante inmovilización en nanopartículas de sílica y posterior entrecruzamiento con glutaraldehído. La actividad y especificidad de la enzima sobre precursores glicosídicos aislados de vino Moscatel blanco, estudiada en vino sintético, demostró un incremento significativo de terpenos, norisoprenoides y fenoles volátiles. Sin embargo, su aplicación directa en vinos no mostró actividad sobre los precursores de agliconas aromáticas, lo que podría deberse a una baja estabilidad en esta matriz, ya que perdió 100% de su actividad al final del proceso. En cambio, la BGL de la cepa de I. terricola 0621 fue activa en todos los vinos estudiados. Esta BGL hidrolizó precursores de tipo norisoprenoides (vomifoliol y 3-oxo-α-ionol) y algunos terpenos tales como cis-8-hidroxilinalool (Tannat y Moscatel) y geraniol (en Tannat). Los estudios sensoriales indicaron que los descriptores encontrados por el panel sensorial se correspondían con los resultados obtenidos mediante GC-MS. Es así que las notas destacadas a frutos secos y miel, característicos de norisoprenoides, concordaron con el análisis mediante GC-MS. El vino tratado con la enzima BGL I. terricola se distinguió incluso frente a los vinos tratados con la preparación comercial de glicosidasas de A. niger, con notas que los evaluadores calificaron como más agradables. Estos resultados obtenidos con la BGL I. terricola representan un hito en cuanto a la liberación de aromas en vinos. Sin embargo, la baja producción constitutiva de la enzima es una limitante para la aplicación enológica. Por lo tanto, se optimizaron las condiciones para la producción de la enzima, modificando los medios de cultivo nutrientes. En cultivos batch en Erlenmeyer, se logró el incremento de la producción de la enzima al doble en comparación a las condiciones utilizadas de rutina, y el proceso fue escalado a biorreactores en cultivos de tipo batch y batch alimentado. Si bien se logró mejorar la producción de actividad BGL, los resultados fueron insuficientes como para permitir una aplicación industrial. Por lo tanto, a continuación se abordaron estrategias de clonado y expresión de la enzima para viabilizar su uso. Visto que el genoma de I. terricola no se encontraba secuenciado, el primer abordaje fue el diseño de cebadores degenerados a partir de fragmentos peptídicos obtenidos del análisis de espectrometría de masas de la proteína pura. Mediante esa estrategia no fue posible hallar fragmentos coincidentes con BGLs reportadas en base de datos. A continuación, en el marco del proyecto FMV_1_2017_1_136574 se identificó la secuencia codificante, lo que permitió el clonado y su expresión en la cepa T73-4 de Saccharomyces cerevisiae. Esta cepa epresenta una alternativa muy promisoria para la producción de BGL I. terricola