Recovery of added value molecules from bio-residues: aesculus hippocastanum L. as a source of saponins and sterols

Mestrado de dupla diplomação com a Université Libre de TunisIt is estimated that about 80% of the world population living in developing countries depends on herbal treatments as primary health and traditional medicine source. Nowadays, even in the most developed countries, plants continue to be of great importance both as sources of nutrients and bioactive compounds. These compounds can exert beneficial functions in our body and are often incorporated into nutraceutical/pharmaceutical formulations. However, and regarding the use of wild species, it is essential to consider that they are a finite natural resource, and their excessive harvest can have negative impacts on ecosystems. In this way and promoting concepts that are currently fundamental in developing technologies and products, namely the circular economy and sustainability, bio-residues have been identified as an excellent source of interesting bioactive compounds. Aesculus hippocastanum L., commonly known as horse-chestnut, is a large tree native to southeastern Europe and widely used as an ornamental and landscape plant in parks and gardens worldwide. Regarding its fruits/seeds, most of them end up in landfills, making these plants a source of bio-residues with no economic value. Horse chestnut seeds are not edible due to the bitter taste conferred by the bioactive compounds present, namely pentacyclic triterpene saponins. Saponins are compounds of high interest since they have multiple bioactivities, being recognized for their anti-inflammatory, hypocholesterolemic, immunomodulatory and even antitumor potential. Although there is an increasingly widespread tendency to adopt environmentally-friend extraction methodologies to obtain interesting compounds, the fact is that conventional technologies are still widely used. Frequently because of their practicality and lower cost, as well as because extraction yields are sometimes lower with green methodologies. According to the abovementioned, the present work aimed to investigate the real difference between conventional techniques (Soxhlet) and more innovative and greener techniques (ultrasound-assisted extraction) for extracting saponins. With this, it is intended to implement the extraction these valuable compounds, which is not performed in our laboratory and is of great interest given their bioactive potential. In addition, since the unsaponifiable fraction of chestnuts seeds can be a source of phytosterols, the chemical characterization of this fraction was also the subject of study. A. hippocastanum seeds (pulp, bark, and skin) were extracted by Soxhlet and ultrasound-assisted extraction (UAE), and to optimise the extraction of saponins from the seed samples the response surface methodology (RSM) was used. The saponins profile of the samples were initially characterised by ultrafast liquid chromatography coupled to a photodiode array (UFLC-PDA), using aescin as standard. Then, and after obtaining the optimal extraction points by RSM, the bioactivity of the A. hippocastanum pulp, skin and bark was evaluated. It was possible to detect saponins, namely aescin, on the samples obtained from both methods, and it was possible to identify the different aescin isoforms all along. For the optimisation, time, solvent/solid ratio, and concentration of solvents (ethanol and methanol) were tested in Soxhlet extraction; for extraction by UAE, time, ultrasonic power, and concentration of solvents (ethanol, and methanol) were tested. The polynomial models were fitted to the experimental data, statistically validated, and used to determine the optimal extraction conditions. Generally, the extraction of the target compounds was greatly affected by all the independent variables. After obtaining the optimal points for the extraction of saponins, both Soxhlet and UAE were performed for the pulp, skin, and bark of A. hippocastanum. The bioactivity of these extracts was evaluated, namely the antimicrobial activity against human pathogens, cytotoxicity in human tumor cells and non-tumor cells, and anti-inflammatory potential. Regarding the antimicrobial properties, gram-positive bacteria, and Aspergillus brasiliensis seemed to be more sensitive pathogens to this type of extracts. However, since no relationship between the type of extraction or solvents was observed, this could be due to possible synergistic effects between saponins and other bioactive compounds. Concerning the cytotoxic and anti-inflammatory activities, generally, the most promising values were obtained for the bark. These results can prove the synergistic effects previously inferred. Overall, this work was based on the recovery of added-value molecules from bio-residues currently without any application or economic value, promoting the recycling of materials and sustainable development, in addition to being a comprehensive study of the methodologies for extracting bioactive compounds of interest. The results of this study could be exploited by companies interested particularly in saponin-rich natural ingredients, such as the pharmaceutical, cosmetic, and food industries.Estima-se que cerca de 80% da população mundial que vive nos países em desenvolvimento depende de tratamentos baseados em plantas como fonte primária de cuidados de saúde e medicina tradicional. Atualmente, mesmo nos países mais desenvolvidos, as plantas continuam a ser de elevada importância, tanto como fonte de nutrientes como de compostos bioativos. Estes compostos podem exercer funções benéficas no nosso organismo e, por isso, são muitas vezes incorporados em formulações nutracêuticas/farmacêuticas. Contudo, e no que diz respeito à utilização de espécies selvagens, importa considerar que estas são um recurso natural finito, e a sua colheita excessiva pode ter impactos negativos nos ecossistemas. Deste modo, e promovendo conceitos que são fundamentais no desenvolvimento de tecnologias e produtos, nomeadamente os conceitos de economia circular e sustentabilidade, os bio-resíduos têm vindo a ser identificados como uma excelente fonte de compostos bioativos de interesse. Aesculus hippocastanum L., vulgarmente conhecido como castanheiro-da-Índia, é uma árvore robusta nativa do sudeste da Europa e amplamente utilizada como planta ornamental e paisagística em parques e jardins de todo o mundo. Embora os frutos e sementes desta árvore possam também ser utilizados para fins ornamentais, a sua maioria acaba em aterros, fazendo destas plantas uma fonte de bio-resíduos sem valor económico. As suas sementes não são comestíveis devido ao sabor amargo conferido pelos compostos bioativos presentes, nomeadamente as saponinas triterpénicas pentacíclicas. As saponinas são compostos de elevado interesse uma vez que possuem múltiplas bioatividades; são reconhecidas pelo seu potencial anti-inflamatório, hipocolesterolémico, imunomodulador e mesmo antitumoral. Embora exista uma tendência em adotar metodologias de extração ecológicas para a obtenção de compostos de interesse, o facto é que as tecnologias convencionais ainda são amplamente utilizadas. Muitas vezes pela sua praticidade e baixo custo, bem como pelos rendimentos de extração que são muitas vezes inferiores quando se utilizam metodologias mais verdes. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar a diferença entre a utilização de técnicas convencionais (Soxhlet) e técnicas mais inovadoras e ecológicas (extração assistida por ultrassons) para extração de saponinas. Desta forma, pretende-se implementar a extração destes compostos a nível laboratorial, uma vez que é de elevado interesse dado seu potencial bioativo. Além disso, como a fração insaponificável das sementes de castanha-da-índia pode ser uma fonte de fitoesteróis, estes compostos foram também alvo de estudo. As sementes de A. hippocastanum (polpa, pele e casca) foram extraídas por Soxhlet e através de extração assistida por ultrassons, e para otimizar a extração de saponinas das amostras foi utilizada a metodologia de superfície de resposta (RSM). O perfil de saponinas das amostras foi inicialmente caracterizado por cromatografia líquida ultra-rápida acoplada a um detetor de díodos (UFLC-PDA), utilizando a aescina como padrão. Em seguida, e após a obtenção dos pontos ótimos de extração por RSM, a bioatividade da polpa, pele e casca de A. hippocastanum foi avaliada. Foi possível identificar saponinas, nomeadamente aescina, nas amostras obtidas por ambos os processos, sendo possível identificar as diferentes isoformas de aescina. Para otimizar a extração das moléculas alvo, foram testados o tempo, a relação solvente/sólido e a concentração dos solventes (etanol e metanol) na extração por Soxhlet; para extração assistida por ultrassons, o tempo, a potência ultrassónica e a concentração de solventes (etanol e metanol) foram testados. Os modelos polinomiais foram ajustados aos dados experimentais, validados estatisticamente e usados para determinar as condições ótimas de extração. No geral, a extração de saponinas foi afetada por todas as variáveis independentes. Após a obtenção dos pontos ótimos para a extração das saponinas, foram efetuados os dois tipos de extração em estudo para a polpa, pele e casca de A. hippocastanum. A bioatividade destes extratos foi avaliada, nomeadamente a atividade antimicrobiana, a citotoxicidade em células tumorais humanas e em células não tumorais, e o potencial anti-inflamatório. Em relação às propriedades antimicrobianas, as bactérias gram-positivas testadas e o fungo Aspergillus brasiliensis foram os patógenos mais sensíveis a este tipo de extratos. No entanto, uma vez que não foi observada relação entre o tipo de extração ou solventes, tal pode ser devido a possíveis efeitos sinérgicos entre saponinas e outros compostos bioativos. Em relação à atividade citotóxica e ao potencial anti-inflamatório, os valores mais promissores foram obtidos para os extratos da casca da castanha da Índia. No geral, este trabalho baseou-se na recuperação de moléculas de valor acrescentado a partir de bio-resíduos atualmente sem aplicação ou valor económico, promovendo a reciclagem de materiais e o desenvolvimento sustentável, além de ser um estudo abrangente das metodologias de extração de compostos bioativos de interesse. Os resultados deste estudo podem ser explorados por empresas interessadas em ingredientes naturais ricos essencialmente em saponinas, como as indústrias farmacêutica, cosmética e alimentar