Optimització del protocol per a la vitrificació d'oòcists bovins madurats in vitro

La criopreservació d'oòcits i embrions de mamífers s'ha convertit en una part integral de la reproducció assistida tant en humans com en espècies veterinàries. No obstant això, els mètodes utilitzats per a criopreservar oòcits i embrions bovins encara mostren deficiències. Mitjançant l'ús de principis fonamentals i models informàtics, les estimacions dels mètodes òptims es poden aconseguir mitjançant una anàlisi racional, amb el potencial d'estalviar una quantitat significativa de recursos en reduir les opcions per a provar mitjançant mètodes empírics. No obstant això, molts dels formalismes de transport que s'utilitzen actualment es basen en suposicions limitants de solució diluïda, sovint apropiades en condicions fisiològiques, però rares vegades adequades en criobiologia, on els crioprotectors s'utilitzen sovint en concentracions elevades. Per tant, el primer objectiu d'aquest treball va ser examinar els efectes de l'augment de les concentracions de CPA sobre la permeabilitat a l'aigua i al CPA en oòcits bovins immadurs i madurats in vitro a través de dos enfocaments matemàtics: el formalisme 2P i el formalisme no diluït. Els resultats van mostrar que la concentració de CPA va afectar la permeabilitat de la membrana del CPA, amb efectes diferencials segons l'etapa de maduració de l'oòcit i el tipus específic de CPA. A més, quan es van comparar els dos enfocaments de modelatge, el primer utilitzant supòsits de solució diluïda i el segon no restringit a aquests supòsits, els resultats mostraren que només existien lleugeres diferències entre les prediccions dels dos models durant els passos d'addició de CPA, i una major diferència durant la primera etapa d'eliminació de CPA. Pel fet que les solucions de vitrificació contenen una alta concentració de crioprotectors, la permeabilitat de la membrana plasmàtica es converteix en un aspecte important per a minimitzar la toxicitat dels CPAs. En conseqüència, el segon objectiu va ser estudiar el paper de les aquagliceroporines en el moviment d'aigua i CPAs en oòcits MII bovins. Els nostres resultats van demostrar que els oòcits bovins MII van expressar AQP3 i AQP7 però no AQP9 quan es van exposar a una solució hiperosmòtica amb l'expressió d'AQP3 regulada a l'alça després de l'exposició a Me2SO, i de l'AQP7 després de l'exposició a EG. A més, també vam demostrar que l'expressió exògena d'AQP7 és possible en oòcits madurats in vitro, i sembla facilitar la difusió d'aigua quan els oòcits bovins MII es troven en presència de solucions de sacarosa o Me2SO però no de EG. No obstant això, aquesta acuaporina no està involucrada en el moviment de Me2SO i EG. Finalment, es va avaluar l'eficiència del model teòric resultant del primer estudi. Basant-nos en observacions osmòtiques in silico i in vitro, vam proposar protocols de deshidratació més curts a diferents temperatures (25°C enfront de 38.5°C) com un primer pas cap a la definició d'un mètode de criopreservació òptim. Les observacions in vitro del comportament osmòtic dels oòcits van indicar que el temps necessari perquè els oòcits aconsegueixin el volum cel·lular d'equilibri després de l'exposició a la solució d'equilibri estàndard va ser de 2 min 30 s a 38.5°C i de 5 min 30 s a 25°C. Posteriorment , vam provar l'eficiència dels temps d'exposició optimitzats per a cèl·lules específiques per a cada temperatura abans de la vitrificació/escalfament en la configuració del fus meiòtic dels oòcits, la fragmentació de l'ADN i el desenvolupament embrionari. Com a resultat, vam poder reduir amb èxit el temps necessari per a preparar oòcits bovins per a la vitrificació a 2 min 30 s quan la vitrificació es va realitzar a 38.5°C, obtenint resultats similars en morfologia del fus, fragmentació de l'ADN i desenvolupament embrionari que els oòcits de control frescos.La criopreservación de ovocitos y embriones de mamíferos se ha convertido en una parte integral de la reproducción asistida tanto en humanos como en especies veterinarias. Sin embargo, los métodos utilizados para criopreservar ovocitos y embriones bovinos todavía muestran deficiencias. Mediante el uso de principios fundamentales y modelos informáticos, las estimaciones de los métodos óptimos se pueden lograr mediante un análisis racional, con el potencial de ahorrar una cantidad significativa de recursos al reducir las opciones para probar mediante métodos empíricos. No obstante, muchos de los formalismos de transporte que se utilizan actualmente se basan en suposiciones limitantes de solución diluida, a menudo apropiadas en condiciones fisiológicas, pero rara vez adecuadas en criobiología, donde los crioprotectores se utilizan a menudo en concentraciones elevadas. Por tanto, el primer objetivo de este trabajo fue examinar los efectos del aumento de las concentraciones de CPA sobre la permeabilidad al agua y al CPA en ovocitos bovinos inmaduros y madurados in vitro a través de dos enfoques matemáticos: el formalismo 2P y el formalismo no diluido. Los resultados mostraron que la concentración de CPA afectó la permeabilidad de la membrana del CPA, con efectos diferenciales según la etapa de maduración del ovocito y el tipo específico de CPA. Además, cuando se compararon los dos enfoques de modelado, el primero utilizando supuestos de solución diluida y el segundo no restringido a esos supuestos, los resultados mostraron que solo existían ligeras diferencias entre las predicciones de los dos modelos durante los pasos de adición de CPA, y una mayor diferencia durante la primera etapa de eliminación de CPA. Debido a que las soluciones de vitrificación contienen una alta concentración de crioprotector, la permeabilidad de la membrana plasmática se convierte en un aspecto importante para minimizar la toxicidad del CPA. En consecuencia, el segundo objetivo fue estudiar el papel de las acuagliceroporinas en el movimiento de agua y CPA en ovocitos bovinos MII. Nuestros resultados demostraron que los ovocitos bovinos MII expresaron AQP3 y AQP7 pero no AQP9 cuando se expusieron a una solución hiperosmótica con la expresión de AQP3 regulada al alza después de la exposición a Me2SO, y de la AQP7 después de la exposición a EG. Además, también demostramos que la expresión exógena de AQP7 es posible en ovocitos madurados in vitro, y parece facilitar la difusión de agua cuando los ovocitos bovinos MII están en presencia de soluciones de sacarosa o Me2SO pero no de EG. Sin embargo, esta acuaporina no está involucrada en el movimiento de Me2SO y EG. Finalmente, se evaluó la eficiencia del modelo teórico resultante del primer estudio. Basándonos en observaciones osmóticas in silico e in vitro, propusimos protocolos de deshidratación más cortos a diferentes temperaturas (25°C frente a 38.5°C) como un primer paso hacia la definición de un método de criopreservación óptimo. Las observaciones in vitro del comportamiento osmótico de los ovocitos indicaron que el tiempo necesario para que los ovocitos alcanzaran el volumen celular de equilibrio tras la exposición a la solución de equilibrio estándar fue de 2 min 30 s a 38.5°C y de 5 min 30 s a 25°C. Posteriormente, probamos la eficiencia de los tiempos de exposición optimizados para las células específicas para cada temperatura antes de la vitrificación/calentamiento en la configuración del huso de los ovocitos, la fragmentación del ADN y el desarrollo posterior del embrión. Como resultado, pudimos reducir con éxito el tiempo necesario para preparar ovocitos bovinos para la vitrificación a 2 min 30 s cuando la vitrificación se llevó a cabo a 38.5°C, obteniendo resultados similares en morfología del huso, fragmentación del ADN y desarrollo embrionario que los ovocitos de control frescos.The cryopreservation of mammalian oocytes and embryos has become an integral part of assisted reproduction in both humans and veterinary species. However, the methods used to cryopreserve bovine oocytes and embryos still have significant shortcomings. By using fundamental principles and computer modeling, estimates of optimal methods can be achieved through rational analysis, with the potential to save a significant amount of resources by narrowing the choices to test via empirical methods. Nevertheless, many of the transport formalisms currently used are based on limiting dilute-solution assumptions often appropriate under physiological conditions, but rarely appropriate in cryobiology where cryoprotectants are often used at high concentrations. Thus, the first objective of this work was to examine the effects of increasing CPA concentrations on water and CPA membrane permeability in immature and in vitro matured bovine oocytes through two different mathematical approaches: the 2P formalism and the nondilute formalism. Results showed that CPA concentration affected membrane CPA permeability, with differential effects depending upon the maturation stage of the oocyte and the specific CPA type. Moreover, when two modeling approaches were compared, the first one using dilute solution assumptions, and the second one not restricted to those assumptions, results indicated that only slight differences exist between the two models' predictions during the CPA loading steps while a greater difference was observed between models during the first stage of CPA removal. Because vitrification solutions contain a high concentration of cryoprotectant, permeability of the plasma membrane becomes an important aspect to minimize CPA toxicity. Accordingly, the second objective was to study the role of aquaglyceroporins in the movement of water and CPA in MII bovine oocytes. Our results demonstrated that MII bovine oocytes expressed AQP3 and AQP7 but not AQP9 when exposed to hyperosmotic solution being AQP3 expression up-regulated after exposure to Me2SO while AQP7 was overexpressed after being in contact with EG hyperosmotic solutions. Moreover, we also demonstrated that exogenous expression of AQP7 is possible in in vitro matured oocytes, and it seems to facilitate water diffusion when bovine MII oocytes are in presence of sucrose or Me2SO solutions but not EG solution. However, this aquaporin is not involved in the movement of Me2SO and EG. Finally, the efficiency of the theoretical model resulting from the first study was assessed. Based on in silico and in vitro osmotic observations, we proposed shorter dehydration-based protocols at different temperatures (25°C vs 38.5°C) as a first step towards defining an optimal cryopreservation method. In vitro observations of the oocytes' osmotic behavior indicated that the time required for the oocytes to reach the equilibrium cell volume upon exposure to standard equilibrium solution was 2 min 30 s at 38.5°C and at 5 min 30 s at 25°C. Subsequently, we tested the efficiency of the optimized cell-specific exposure times for each temperature prior to vitrification/warming on oocyte spindle configuration, DNA fragmentation and further embryo development. As a result, we were able to successfully reduce the necessary time to prepare bovine oocytes for vitrification to 2 min 30 s when vitrification was carried out at 38.5°C, obtaining similar results on spindle morphology, DNA fragmentation and embryo development than fresh control oocytes