Chronic overproduction of IL6 and IL10 modulates the microglial response after anterograde degeneration

En el SNC, la neuroinflamació pot estar provocada per diversos orígens com ara malalties agudes o cròniques; produeix tant l'activació glial com de cèl·lules de la perifèria. De totes elles, la micròglia té un rol molt important ja que es la representant del sistema immune en el cervell. La resposta microglial està caracteritzada per canvis en el seu fenotip, activitat fagocítica, canvis morfològics i per la secreció de molècules immunomoduladors com les citocines. Les citocines són molècules que modulen el microambient i per tant tenen un paper molt important dirigint l'activació microglial. En aquest sentit, les citocines IL-6 i IL-10 s'han perfilat com dos gran immunomoduladors de la micròglia però es desconeix el mecanisme d'acció. En aquest sentit, l'objectiu d'aquesta tesis es determinar les modificacions que produeix una producció local de IL-6 i IL-10 en la resposta inflamatòria associada a una degeneració anterògrada. Per aconseguir-ho, realitzarem l'axotomia de la via perforant utilitzant dos animals transgènics que produeixen IL-6 i IL-10 sota l'acció del promotor GFAP localitzat en astròcits. Els nostres resultats demostren que l'acció crònica de IL-6 i IL-10 polaritza les cèl·lules de micròglia en condicions basals. Després de la lesió, la producció crònica de les dues citocines augmenta la densitat de la població de micròglia/macròfags. En el cas dels animals GFAP-IL6Tg es degut tant a un augment de la proliferació microglial com del reclutament de monòcits, mentre que en els animals GFAP-IL10Tg es produeix només per la infiltració de monòcits. A més a més, tant la producció crònica de IL-6 com de IL-10 produeix canvis en la maquinaria fagocítica de les cèl·lules microglials. No obstant, observem un augment de fibres degenerant a la capa molecular dels animals GFAP-IL6Tg. En relació a les cèl·lules immunes de la perifèria, a part dels monòcits, tots dos animals presenten un augment de la infiltració limfocitària. En aquest sentit, un dels resultats més interessants d'aquest estudi es que tant la IL-6 com la IL-10 modifiquen el fenotip de presentació antigènic de les cèl·lules de micròglia. De fet, els animals GFAP-IL6Tg no presenten micròglia MHCII+ i CD11c+ restringit només a la població de macròfags perivasculars. En canvi, els animals GFAP-IL10Tg també presenten canvis, però tenen una menor nombre de població expressant aquests marcadors. A més a més, els nostres resultats mostren modificacions en l'ambient de citocines. De fet, la producció crònica de IL-6 augmenta l'expressió de les citocines pro-inflamatòries IL-6 i IL-1β , associades a un resposta innata; com també alts nivells de IL-10. En el cas de l'animal GFAP-IL10Tg, observem un ambient més pro-inflamatori derivat principalment d'un augment en TGF-β i baixos nivells de IL-2 i IFN-γ. A més a més, els dos transgènics presenten interferències entre la comunicació de micròglia i neurones a traves de l'eix CD200-CD200R. Finalment, la sobreexpressió crònica de IL-6 redueix el sprouting collateral mentre que no s'observen diferencies en els animals GFAP-IL10Tg. En conclusió, aquests resultats revelen que la sobre producció local de IL-6 i IL-10 polaritza les cèl·lules de micròglia cap a un estat "primed". Una vegada que aquestes cèl·lules s'han exposat a un mateix segon estímul, la lesió de PPT, presenten un perfil d'activació diferent condicionat pel primer estímul. De fet, la micròglia IL6-primed presenta un perfil d'activació que impedeix adquirir la seva funció de presentació antigènica, mentre que la micròglia IL10-primed mostra una baixa regulació del perfil de cèl·lula APC. Aquests canvis en la micròglia només modifiquen la resolució del dany en els animals GFAP-IL6Tg evitant la generació d'un ambient pro-regeneratiu.En el SNC, la neuroinflamación puede estar provocada por varios factores como enfermedades agudas o crónicas; produciendo tanto la activación glial com la de células procedentes de la periferia. De todas ellas, la microglia desempeña un rol muy importante ya que es la representante del sistema inmune en el cerebro. La respuesta microglial esta caracterizada por cambio en su fenotipo, actividad fagocítica, cambios morfológicos y por la secreción de moléculas inmunomoduladoras como las citocinas. Las citocinas son moléculas que modulan el microambiente y per lo tanto tienen un papel muy importante dirigiendo la activación microglial. En este sentido, las citocinas IL-6 y IL-10 se han perfilado como dos grandes immunomoduladores de la microglia pero se desconoce su mecanismo de acción. En este sentido, el objetivo de esta tesis es determinar las modificaciones que produce una producción local de IL-6 y IL-10 en la respuesta inflamatoria asociada a una degeneración anterógrada. Para ello, realizamos la axotomia de la vía perforante en dos animales transgénicos que producen IL-6 y IL-10 por la acción del promotor GFAP localizado en astrocitos. Nuestros resultados demuestran que la acción crónica de IL-6 y IL-10 polariza las células de microglia en condiciones basales. Después de la lesión, la producción crónica de las dos citosinas aumenta la densidad de la población de microglia/macrófagos. En el caso de los animales GFAP-IL6Tg es debido a un aumento de la proliferación microglial como del reclutamiento de monocitos, mientras que en los animales GFAP-IL10Tg solo es debido a la infiltración de monocitos. Además, tanto la producción crónica de IL-6 como de IL-10 produce cambios en la maquinaria fagocítica de las células de microglia. No obstante, observamos un aumento de fibras degenerativas en la capa molecular de los animales GFAP-IL6Tg. En relación a las células inmunes de la periferia, a parte de los monocitos, los dos animales presentan un aumento de la infiltración linfocitaria. En este sentido, uno de los resultados mas interesantes de este estudio es que tanto la IL-6 como la IL-10 modifican el fenotipo de presentación antigénica de las células de microglia. De hecho, los animales GFAP-IL6Tg no presenten microglia MHCII+ ni CD11c+ restringiendo así su expresión en la población de macrófagos perivasculars. En cambio, los animales GFAP-IL10Tg también presentas alteraciones, pero presentan un menor número de población expresando estos marcadores. Además, nuestros resultados muestran modificaciones en el ambiente de citosinas. De hecho, la producción crónica de IL-6 aumenta la expresión de las citosinas pro-inflamatorias IL-6 y IL-1β , asociadas a una respuesta innata; como también muestran elevados niveles de IL-10. En el caso de los GFAP-IL10Tg, observamos un ambiente más pro-inflamatorio derivado principalmente de un aumento en TGF-β y bajos niveles de IL-2 y IFN-γ. Además, los dos transgénicos presentan interferencias entre la comunicación de microglia-neurona a través del eje CD200-CD200R. Finalmente, la sobreexpresión crónica de IL-6 reduce el sprouting collateral mientras que no se observan diferencias en los animales GFAP-IL10Tg. En conclusión, estos resultados demuestran que la sobre producción, local de IL-6 y IL-10 polariza las células de microglia hacia un estado "primed". Una vez que estas células se han expuesto a un mismo segundo estímulo, la lesión de PPT, presentan un perfil de activación diferente condicionado por el primer estímulo. De hecho, la microglia IL6-primed presenta un perfil de activación que impide adquirir su función de presentación antigénica, mientras que la microglia IL10-primed muestra una menor regulación de su perfil de célula APC. Estos cambios en la microglia solo modifican la resolución del daño en los animales GFAP-IL6Tg evitando la generación de un ambiente pro-regenerativo.In CNS, neuroinflammation might be evoked by a variety of scenarios including acute or chronic brain diseases; producing activation of glial and immune peripheral cells. Among glial cells, microglia play a specific role being the representative of the immune system within the CNS. Their response against the damage is fast and characterized by adopt morphological changes, increased proliferate rate, migration, phagocytosis and secrete immunomodulatory molecules like cytokines. Cytokines are crucial molecules involved in the modulation of the molecular microenvironment and hence play a pivotal role in orchestrating microglial activation. In this sense, IL-6 and IL-10 has been proposed as a two immunoregulatory molecules of microglial cells, but their specific role remains unclear due to their controversial roles after brain diseases. In this context, the objective of the present thesis is to determine the modifications that local overproduction of IL-6 and IL-10 can exert on microglia cells and their implication in the evolution and resolution of the inflammatory process associated with an anterograde axonal injury. To address it, we performed the perforant pathway transection (PPT) in two transgenic mice, GFAP-IL6Tg and GFAP-IL10Tg, which produce the cytokines IL-6 and IL-10, respectively, under the GFAP promoter in astrocytes. Our results showed that, in steady state, both IL-6 and IL-10 chronic overproduction have the capacity to polarize microglial phenotype. After PPT, astrocyte-targeted production of both cytokines increases microglial/macrophage density. In the case of GFAP-IL6Tg mice this increase is due to both microglial proliferation and recruitment of monocytes, whereas in GFAP-IL10Tg is only produced by higher monocyte infiltration. Moreover, both IL-6 and IL-10 chronic overproduction changes microglial phenotype increasing the microglial phagocytic machinery. However, only IL-6 induces higher levels of TREM2, although reduces the clearance of neurodegenerating fibers in the dennervated area. About the peripheral immune cell recruitment, in addition to the increase in monocytes, in both transgenic animals we observe an upregulation of chemokines linked to the increase in T-cell infiltration. In this regard, one of the most interesting results obtained in this study is that both IL-6 and IL-10 chronic overproduction modifies the antigen presenting capacity of microglial cells worsening their interaction with recruited lymphocytes. Specifically, GFAP-IL6Tg animals were depleted of MHCII+ and CD11c+ microglia cells in the parenchyma being this expression restricted to perivascular macrophages. The MHCII and CD11c expression was also impaired in GFAP-IL10Tg, showing less number of microglia cells expressing these markers after PPT. In addition to microglia and peripheral immune cell infiltration, our results also show modifications in the cytokine environment in both transgenic animals. Indeed, IL-6 chronic overproduction increases IL-6 and IL-1β pro-inflammatory cytokines, associated to innate immune response; and shows elevated levels of the anti-inflammatory cytokine IL-10. In the case of IL-10 astrocyte-targeted production, we observed an anti-inflammatory environment mainly with higher TGF-β and lower IL-2 and IFN-γ. Furthermore, both astrocyte-targeted production of IL-6 and IL-10 interferes in the communication between microglia and neurons trough the CD200R-CD200 axis. Finally, IL-6 chronic overexpression reduces the collateral sprouting associated to PPT, whereas IL-10 chronic overexpression does not modify this process. In conclusion, the results obtained in this thesis indicate that chronic and local exposure to IL6 and IL10 polarized the microglia towards a primed phenotype. Once they are exposed to a same second stimulus, the PPT paradigm, they present a different microglial activation profile conditioned by the first stimuli. Specifically, IL6-primed microglia present an activated profile unable to acquire an antigenic presentation function; whereas IL10-primed microglia shows a downregulated APC phenotype after PPT. These changes in microglial population only modify the outcome of lesion in GFAP-IL6Tg mice avoiding the generation of a pro-regenerative environment