Freeze-drying of nanofibrillated cellulose hydrogel and cells for pharmaceutical applications

Freeze-drying is a widely used desiccation method for the preservation of protein drugs and vaccines in a dry state. In freeze-drying, the specimens are first frozen and then dried under a vacuum. The end products are dry products that can be preferably transported without a cold chain and stored at room temperature for years. Despite the common utilization of freeze-drying with proteins and vaccines, optimization of the process for cells and nature-origin biomaterials is problematic. This thesis aimed to change the current paradigm of trial-and-error in the freeze-drying of biomaterials and cells. The research focused on finding new excipients, applying new strategies to improve the results, adapting already existing process analytical technology (PAT) for the new specimen, and improving the current understanding of freeze-drying in general by providing explanations of the mechanism of actions of the excipients. The sub-projects (publications) of this thesis focused on characterizing the freeze-dried nanofibrillated cellulose aerogel, evaluating the effects of nanofibrillated cellulose hydrogel on cells during freeze-drying, setting up old methods for new applications for freeze-drying of nanofibrillated cellulose hydrogel, and studying the applications of freeze-dried nanofibrillated cellulose aerogel in 3D cell culturing. This thesis improved the theoretical understanding of freeze-drying, especially when considering the complex natural biomaterials and cells. The requirements of these specimens were recognized and existing theories of the mechanism of the protection provided by the excipients were applied to the samples. Furthermore, new theoretical aspects of the protection were proposed and the effect of nanofibrillated cellulose as a lyoprotectant was shown. In addition to the theoretical improvements, this thesis provided adaption of already existing PAT into the freeze-drying of biomaterials and an improved method for 3D cell culturing which can be potentially applied later for high-throughput screening of drug candidates.Kylmäkuivaus on laajasti käytetty menetelmä esimerkiksi proteiinilääkkeiden ja rokotteiden säilyvyyden parantamiseksi. Kylmäkuivauksessa tuotteet jäädytetään ja tämän jälkeen kuivataan erittäin matalassa paineessa. Tavoitteena on, että lopputuotteet voidaan säilyttää kuivina ja kuljettaa huoneenlämmössä ilman kylmäketjua. Vaikka kylmäkuivausta käytetään laajasti lääketeollisuudessa proteiinilääkkeiden ja rokotteiden valmistuksessa, menetelmän laajentaminen monimutkaisiin luonnon biomateriaaleihin tai elävien solujen säilömiseen on haastavaa. Kylmäkuivauksen soveltaminen suoraan soluihin ja biomateriaaleihin huomioimatta kyseisten näytteiden tyypillisiä vaatimuksia johtaa helposti "yritys ja erehdys" -ajatteluun. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli muuttaa vanhentunut ajattelumalli solujen ja biomateriaalien kylmäkuivauksessa. Tutkimuksessa etsittiin uusia apuaineita kylmäkuivaukseen, hyödynnettiin olemassa olevia analyysitekniikoita uusiin sovelluksiin ja pyrittiin selittämään apuaineiden toimintaperiaatteita biomateriaalien ja solujen kylmäkuivauksen yhteydessä. Väitöskirjan osatöissä keskityttiin kylmäkuivatun nanoselluloosa-aerogeelin tutkimiseen, solujen kylmäkuivaukseen nanoselluloosahydrogeelin kanssa, kehitettiin uusia sovelluksia olemassa oleville analyysitekniikoille ja tutkittiin kylmäkuivatun nanoselluloosa-aerogeelin käytettävyyttä 3D solukasvatukseen. Tutkimus lisäsi yleisesti tietoa kylmäkuivauksesta erityisesti koskien biomateriaaleja ja soluja. Näytteiden suojaamiseen liittyvät kriittiset ominaisuudet tunnistettiin ja jo olemassa olevia teorioita sovellettiin biomateriaaleille ja soluille sopiviksi. Tämän lisäksi esitettiin uusia teoreettisia näkökulmia biomateriaalien ja solujen kylmäkuivauksen onnistumiseksi. Teoreettisten lopputulemien lisäksi väitöskirjassa osoitettiin uusi sovellus olemassa olevalle analyysitekniikalle ja kylmäkuivatun nanoselluloosa-aerogeelin hyödyntämiselle 3D solukasvatuksessa