New Applications for TR-FRET-based Homogeneous Immunoassays in Diagnosis of Infectious and Autoimmune Diseases

Infectious and autoimmune diseases contribute considerably to the global disase burden. Diagnosis of these diseases often involves detection of patient antibodies or antigens. New detection technologies may provide added value and reduced costs by offering faster turnaround times, higher throughput, better diagnostic performance, reduced material and labour costs and suitability for point-of-need testing. This thesis explored the possibilities of time-resolved Förster resonance energy transfer (TR-FRET)-based rapid antibody and antigen detection for the diagnosis of infectious and autoimmune diseases. FRET involves energy transfer from a donor to an acceptor fluorophore, but only if in close proximity. The requirement for proximity is utilized in homogeneous immunoassays to detect the antigen-antibody interaction by the use of fluorophore-labelled antigens, antibodies and antibody-binding molecules. In TR-FRET, the time-resolved measurement allows for more sensitive FRET pair detection by reducing the autofluorescent background inherent to biological materials. Here, three types of TR-FRET assays were set up and evaluated, two for the detection of antibodies and one for antigens. In study I, a competitive homogeneous immunoassay termed CFRET (competitive TR-FRET assay) was set up for the detection of serum Puumala orthohantavirus antibodies, a key analyte in the diagnosis of HFRS (hemorrhagic fever with renal syndrome), a common zoonosis in Northern Europe. In the assay, a donor-labelled antigen and an acceptor-labelled monoclonal antibody form a FRET pair, with serum antibodies competitively decreasing the FRET signal. Sensitivity of 100% and specificity of 99% for diagnosis of acute infection were achieved with an assay time of 30 minutes. In the second study (II), a protein L-based homogeneous TR-FRET immunoassay (LFRET) was set up for detection of tissue transglutaminase antibodies used in diagnosis of coeliac disease. Donor-labelled antigen and acceptor-labelled kappa light chain–binding protein L are brought in proximity by serum antibodies, resulting in increased FRET signal. With an assay time of 22 minutes, the LFRET had a specificity of 94% and sensitivity of 88%, respective figures for EIA being 92% and 96%. The study demonstrated the applicability of LFRET for the detection of IgA and diagnosis of an autoimmune diseases. In study III, LFRET was applied to serodiagnosis of SARS-CoV-2 by detection of antibodies against nucleoprotein (NP) and S protein (SP). The assays required only combining the sample with a reagent mix and reading the result after 7 minutes, and paralleled ELISA in sensitivity, specificity and prediction of neutralization capacity. The fourth study (IV) utilized TR-FRET for the detection of SARS-CoV-2 antigens NP and SP in nasopharyngeal swab samples. To this end, two sets of antibodies labelled with either donor or acceptor were used. If present, the antigen brings the labelled antibodies into close proximity, resulting in a FRET-active complex. The signal is measured directly after adding the sample to the reagent mix. As compared to virus isolation, which likely best reflects infectivity, the TR-FRET NP assay had a sensitivity of 97% and specificity of 100%. Compared to RT-PCR, sensitivity and specificity were 77% and 99%, and all samples with a Ct value < 25 were identified. The assays developed are successively simpler and faster to perform, and the assay principles applicable to most if not all antigens or antibodies of clinical interest. The performance of the rapid TR-FRET assays could further be improved by e.g. use of antibody binders not limited to kappa light chains or incorporating new elements such as oligonucleotides to the assays. Considering the versatility of the technology, a TR-FRET reader could be envisioned as the comprehensive rapid biomarker detector for 24/7 emergency department laboratory services.Tartunta- ja autoimmuunitaudit muodostavat merkittävän osan maailmanlaajuisesta tautitaakasta. Monien tartuntatautien toteamiseksi tutkitaan, onko potilasnäytteessä viruksen osasia (antigeenejä) tai niitä vastaan elimistössä kehittyviä vasta-aineita. Autoimmuunitaudeissa puolestaan voi esiintyä elimistöön itseensä kohdistuvia vasta-aineita. Väitöstyössä kehitettiin aikaerotteiseen Försterin resonanssienergiansiirtoon (engl. time-resolved Förster resonance energy transfer, TR-FRET) perustuvia vasta-aine- ja antigeenipikatestejä tartunta- ja autoimmuunitautien tunnistamiseen. FRET-ilmiössä energiaa siirtyy kahden erilaisen leimamolekyylin välillä vain, jos nämä ovat lähekkäin. Kun ensimmäistä leimamolekyyliä viritetään UV-valolla, säteilee se viritystilan purkautuessa kellertävää valoa. Mutta jos virittyneen leimamolekyylin välittömässä läheisyydessä on toinen leimamolekyyli, viritystilan purkautumisenergia virittääkin tämän toisen (= FRET-ilmiö). Viimemainitun molekyylin viritys purkautuu punertavana valona, jonka havaitseminen kertoo molekyylien olevan lähekkäin. Kytkemällä leimat erilaisiin biomolekyyleihin ilmiötä voidaan käyttää hyväksi mm. vasta-aineiden ja antigeenien tunnistamiseen. Väitöstutkimuksessa kehitettiin uudenlaisia TR-FRET -pikatestejä myyräkuumeessa, SARS-CoV-2 -tartunnassa ja autoimmuunitauti keliakiassa ilmenevien vasta-aineiden sekä SARS-CoV-2 -virusantigeenien osoitukseen. Myyräkuumetestimme tunnisti 30 minuutissa kaikki akuutit myyräkuumetapaukset. Keliakiatesti osoitti TR-FRET -menetelmien soveltuvan IgA-luokan vasta-aineiden tunnistukseen ja tunnisti keliakian 22 minuutissa liki vertailumenetelmän (EIA, entsyymi-immunologinen määritys) veroisesti. 7 minuutin SARS-CoV-2-vasta-ainetesti oli EIA-vertailumenetelmän veroinen. COVID-19 -antigeenitesti antoi tuloksen alle 10 minuutissa ja tunnisti 97 % sellaisista näytteistä joista virusviljelyllä voitiin osoittaa aktiivista koronavirusta. Antigeenitestin tarkkuus verrattuna RT-PCR -testiin oli 99 %, eli jotakuinkin kaikki positiiviset tulokset olivat oikeita. Herkkyys oli 77 %, samaa luokkaa kuin muilla antigeenitesteillä. Väitöstyössä kehitetyt menetelmät antigeenien ja vasta-aineiden tunnistamiseen olivat nopeita ja helppoja suorittaa ja sovellettavissa laajalti eri sairauksien pikadiagnostiikkaan. TR-FRET -lukulaitteesta voisikin tulla tulevaisuuden yleispätevä biomarkkeripikatunnistin