Towards waste valorization: Recovery of valuable compounds from animal by-products and opportunities of application

La indústria càrnia genera enormes quantitats de deixalles, que s'han de tractar i gestionar adequadament per evitar problemes ambientals i de salut. El reciclatge de residus i subproductes animals en productes de valor afegit podria ajudar a revertir aquest problema. Per tant, diversos enfocaments han estat adaptats per la ciència i la tecnologia, acoblant-los amb els coneixements del mercat, la legislació i els consumidors per a la valorització amb èxit d'aquests residus en el marc de l'Economia Circular. Aquesta Tesi Doctoral s'enfoca en un residu subestimat i sense explotar produït durant el procés de tractament de subproductes carnis, anomenat fins. Donat el seu alt contingut en lípids i proteïnes, aproximadament del 37 i 46% respectivament, la investigació es va centrar en la recuperació d'aquests components per a futures aplicacions. Es van establir tres etapes principals: 1.a recuperació de la fracció lipídica, 2.a recuperació de proteïnes en forma de hidrolitzats de proteïnes i 3.a aplicacions potencials dels hidrolitzats de proteïnes. En primer lloc, els fins es van sotmetre a cinc mètodes diferents per extreure la fracció lipídica: mètode de Soxhlet, mètode de Folch, extracció amb ciclopentil metil èter, extracció aquosa i extracció enzimàtica aquosa. Després de l'avaluació de les metodologies emprades en termes de rendiment i l'assignació de punts de penalització en base a l'Eco-Scale, es va triar l'extracció aquosa com el mètode més ecològic. Aquest mètode permet superar els principals inconvenients dels mètodes clàssics, com la generació de gran quantitat de residus i les emissions de vapors orgànics. Atès que l'aigua no és un solvent perillós, el greix es va extreure amb èxit i alhora es van obtenir fins parcialment desgreixats (PDF) per a la següent fase. Finalment, la consistència del greix extret es va optimitzar, obtenint un producte semi-sòlid, a punt per a la seva aplicació com a ingredient en l'alimentació animal. En segon lloc, es van utilitzar dues proteases disponibles comercialment, Alcalasa 2.4L i Neutrasa 0.8L, per recuperar la fracció proteica present en els PDF. Es van optimitzar les condicions d'hidròlisi amb l'objectiu de maximitzar el grau d'hidròlisi (DH) i el procés es va monitoritzar mitjançant el reactiu o-ftalaldehid (OPA). El DH màxim assolit amb l'enzim Alcalasa 2.4L va ser 21,4 % en les següents condicions òptimes: ràtio E/S 5%, pH 8, temperatura 55 °C y temps 24 h. L'enzim Neutrasa 0.8L va exhibir una menor eficiència en la hidròlisi de les proteïnes presents en els PDF i, per tant, una menor recuperació de proteïna. Després de l'optimització de quatre variables (ràtio E/S, pH inicial, temperatura i temps) a través de la metodologia de superfície de resposta (RSM), el DH màxim aconseguit va ser 7,2% en les següent condicions: ràtio E/S 15%, pH inicial 8, temperatura 40 °C i temps 10,5 h. Els perfils peptídics de les hidròlisi es van determinar mitjançant electroforesi (SDS-PAGE) i cromatografia d'exclusió molecular (SEC), mostrant el predomini dels pèptids < 5 kDa en els hidrolitzats obtinguts. La hidròlisi enzimàtica va tenir un gran impacte en el perfil dels compostos volàtils i els grups funcionals. No obstant això, es van observar similituds entre els perfils aminoacídics dels hidrolitzats i els PDF. A més, es van determinar els factors de conversió de nitrogen a proteïna (NPCF) per a les diferents fraccions obtingudes. Finalment, el procés es va escalar (10 vegades), realitzant el pas de matràs a reactor amb èxit, demostrant la viabilitat de l'escalat. Finalment, es va avaluar la utilitat dels hidrolitzats de proteïnes produïts com a font de nitrogen de baix cost. Els hidrolitzats de proteïnes es van incorporar com a font de proteïna en medis de cultius per a microbiologia com a substituts de les peptones, o com a bioestimulants per a plantes. La capacitat dels hidrolitzats de proteïna per sustentar el creixement bacterià va ser excel·lent, fins i tot van superar la capacitat de les fonts de nitrogen comercials en alguns casos. En el cas dels llevats, els efectes van ser dependents de la soca: una de les soques va mostrar un bon rendiment mentre que l'altra va exhibir menor creixement i capacitat de fermentació en presència dels hidrolitzats de proteïna de baix cost. La suplementació amb els hidrolitzats de proteïna obtinguts va tenir un efecte positiu per diverses soques de fongs, millorant la seva capacitat per transformar el 5-hidroximetilfurfural quan aquests microorganismes es van emprar com a biocatalitzadors. Finalment, els hidrolitzats de proteïna no van millorar el creixement de les plantes de tomàquet i rave. En conclusió, la present Tesi Doctoral proporciona una visió de les oportunitats per extreure compostos de valor afegit dels fins a través de pràctiques sostenibles.La industria cárnica genera enormes cantidades de desechos, que deben tratarse y gestionarse adecuadamente para evitar problemas ambientales y de salud. El reciclaje de residuos y subproductos animales en productos de valor añadido podría ayudar a revertir este problema. Por lo tanto, diversos enfoques han sido adaptados por la ciencia y la tecnología, acoplándolos con los conocimientos del mercado, la legislación y los consumidores para la valorización exitosa de estos residuos en el marco de la Economía Circular. Esta Tesis Doctoral se centra en un residuo subestimado y sin explotar que se produce durante el proceso de tratamiento de subproductos cárnicos, llamado finos. Dado su alto contenido en lípidos y proteínas, aproximadamente del 37 y 46% respectivamente, la investigación se focalizó en la recuperación de estos componentes para futuras aplicaciones. Se establecieron tres etapas principales: 1.a recuperación de la fracción lipídica, 2.a recuperación de proteínas en forma de hidrolizados de proteínas y 3.a aplicaciones potenciales de los hidrolizados de proteínas. En primer lugar, los finos se sometieron a cinco métodos diferentes para extraer la fracción lipídica: método de Soxhlet, método de Folch, extracción con ciclopentil metil éter, extracción acuosa y extracción enzimática acuosa. Después de la evaluación de las metodologías empleadas en términos de rendimiento y la asignación de puntos de penalización en base al Eco-Scale, se eligió la extracción acuosa como el método más ecológico. Este método permite superar los principales inconvenientes de los métodos clásicos, como la generación de gran cantidad de residuos y las emisiones de vapores orgánicos. Dado que el agua no es un solvente peligroso, la grasa se extrajo con éxito mientras se obtuvieron finos parcialmente desgrasados (PDF) para la siguiente fase. Por último, la consistencia de la grasa extraída se optimizó, obteniendo un producto semisólido, listo para su aplicación como ingrediente en la alimentación animal. En segundo lugar, se utilizaron dos proteasas disponibles comercialmente, Alcalasa 2.4L y Neutrasa 0.8L, para recuperar la proteína presente en los PDF. Se optimizaron las condiciones de hidrólisis con el objetivo de maximizar el grado de hidrólisis (DH) y el proceso se monitorizó mediante el reactivo o-ftalaldehído (OPA). El DH máximo alcanzado con la enzima Alcalasa 2.4L fue 21,4 % en las siguientes condiciones óptimas: ratio E/S 5%, pH 8, temperatura 55 °C y tiempo 24 h. La enzima Neutrasa 0.8L exhibió una menor eficiencia en la hidrólisis de las proteínas presentes en los PDF y, por consiguiente, una menor recuperación de proteína. Después de la optimización de cuatro variables (ratio E/S, pH inicial, temperatura y tiempo) a través de la metodología de superficie de respuesta (RSM), el DH máximo alcanzado fue 7,2% en las siguientes condiciones: ratio E/S 15%, pH inicial 8, temperatura 40 °C y tiempo 10,5 h. Los perfiles peptídicos de las hidrólisis se determinaron mediante electroforesis (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión molecular (SEC), mostrando el predominio de los péptidos < 5 kDa en los hidrolizados obtenidos. La hidrólisis enzimática tuvo un gran impacto en el perfil de los compuestos volátiles y los grupos funcionales. Sin embargo, se observaron similitudes entre los perfiles aminoacídicos de los hidrolizados y los PDF. Además, se determinaron los factores de conversión de nitrógeno a proteína (NPCF) para las diferentes fracciones obtenidas. Por último, el proceso se escaló (10 veces), realizando el paso de matraz a reactor exitosamente, demostrando la viabilidad del escalado. Finalmente, se evaluó la utilidad de los hidrolizados de proteínas producidos como fuente de nitrógeno de bajo coste. Los hidrolizados de proteínas se incorporaron como fuente de proteína en medios de cultivos para microbiología como substitutos de las peptonas, o como bioestimulantes para plantas. La capacidad de los hidrolizados de proteína para sustentar el crecimiento bacteriano fue excelente, incluso superaron la capacidad de las fuentes de nitrógeno comerciales en algunos casos. En el caso de la levadura, los efectos fueron dependientes de la cepa: una de las cepas probadas mostró un buen rendimiento mientras que la otra exhibió menor crecimiento y capacidad de fermentación en presencia de los hidrolizados de proteína de bajo coste. La suplementación con los hidrolizados de proteína obtenidos tuvo un efecto positivo para varias cepas de hongos, mejorando su capacidad para transformar el 5-hidroximetilfurfural cuando estos microorganismos se emplearon como biocatalizadores. Finalmente, los hidrolizados de proteína no mejoraron el crecimiento de las plantas de tomate y rábano. En conclusión, la presente Tesis Doctoral proporciona una visión de las oportunidades para extraer compuestos de valor añadido de los finos a través de prácticas sostenibles.Meat industry generates vast amounts of waste, which must be properly treated and managed to avoid environmental and health concerns. The recycling of animal co- and by-products into added-value products could help turn this problem around. Hence, diverse science and technology-driven approaches have been coupled with market, legislative, and consumer knowledge for the successful valorization of these residues in the frame of Circular Economy. This Ph.D. thesis addresses an underestimated and therefore unexploited waste produced during the rendering process, called fines. Given its high content in lipids and protein, of around 37 and 46%, respectively, the focus was placed on the recovery of these components for further applications. Thus, three main phases were established: 1st fat recovery, 2nd protein recovery as protein hydrolysates, and 3rd potential applications of protein hydrolysates. Firstly, fines were submitted to five different methods to extract the lipidic fraction: Soxhlet method, Folch method, extraction with cyclopentyl methyl ether, aqueous extraction, and aqueous enzymatic extraction. After evaluating the employed methodologies in terms of yield and assigning penalty points based on the Eco-Scale approach, the aqueous extraction was chosen as the greenest method. It allows overcoming the main drawbacks of classical methods, such as the generation of a high amount of waste and organic vapor emissions. Since water is a non-hazardous solvent, the fat was successfully extracted while preparing partially defatted fines (PDF) for the next phase. The consistency of the extracted fat was optimized, obtaining a semi-solid product ready for application as an ingredient in animal feed. Secondly, two commercially available proteases, Alcalase 2.4L and Neutrase 0.8L were used to recover the protein from PDF. Hydrolysis conditions were optimized aiming to maximize the degree of hydrolysis (DH), monitored using the o-phthaldialdehyde (OPA) assay. The maximum DH achieved with Alcalase 2.4L was 21.4% under optimal conditions: E/S ratio 5%, pH 8, temperature 55 °C, and time 24 h. Neutrase 0.8L exhibited lower efficiency in hydrolyzing the protein present in PDF and therefore, lower protein recovery. After optimizing four variables (E/S ratio, initial pH, temperature, and time) through Response Surface Methodology (RSM), the maximum DH achieved was 7.2% with the variables set at: E/S ratio 15%, initial pH 8, temperature 40 °C, and time 10.5 h. Peptides profiles were displayed using electrophoresis (SDS-PAGE) and size exclusion chromatography (SEC), indicating that most of the peptides in the hydrolysates were < 5 kDa. Enzymatic hydrolysis had a significant impact on the volatiles profile and functional groups. However, the amino acid profiles of the hydrolysates and PDF were very similar. In addition, nitrogen-to-protein conversion factors (NPCF) were determined for the different fractions obtained. Lastly, the process was scaled-up (10-fold) from shake-flask to a reactor successfully, demonstrating the feasibility for future scale-up. Finally, the usefulness of the obtained protein hydrolysates as a low-cost nitrogen source was assessed. The protein hydrolysates were incorporated as protein ingredients in microbiological growth media replacing peptones or as biostimulants for plants. The capacity of protein hydrolysates to support bacterial growth was excellent, even outperforming commercial ones in some cases. In the case of yeast, the effects were strain-dependent: one of the tested strains displayed good performance while the other one exhibited lower growth and fermenting capacity in the presence of the low-cost protein hydrolysates. Several fungi strains took advantage of the low-cost protein hydrolysates, improving their capability to transform 5-hydroxymethylfurfural when used as whole-cell biocatalysts. Finally, the protein hydrolysates did not improve tomato and radish plants growth. In conclusion, the present Doctoral Thesis provides an insight into the opportunities for extracting compounds with added-value from fines through sustainable practices