Regulation of physiological and tumoral angiogenesis by the chemerin system

Angiogenesis is an essential and complex process, by which new blood vessels grow from preexisting ones, as a tightly regulated response of endothelial cells (ECs) to a combination of pro- and anti-angiogenic factors. The establishment of a functional blood vessel network is initiated by the formation of a primitive vascular plexus, from which new blood vessels sprout, coordinately expand, and branch. Redundant vessel branches are then selectively removed through vessel regression, a process called pruning.Chemerin was originally isolated from inflammatory exudate fluids and found to be a ligand for the orphan G protein-coupled receptor, ChemR23/CMKLR1. Active chemerin is a chemoattractant factor for immature dendritic cells, natural killer cells and macrophages, by acting through CMKLR1. Bioactive chemerin generation and infiltration by CMKLR1-expressing cells have been described in various human diseases. We and others have identified both pro- and anti-inflammatory activities of the chemerin/CMKLR1 system according to the experimental setting. Our laboratory reported the antitumor activity of chemerin in a chemical model of skin carcinogenesis, and more recently, in two tumor graft models. These anti-tumoral properties were reported as independent from leukocyte recruitment. Instead, a reduction of the neoangiogenesis process was identified as the driving mechanism explaining the delay in tumor growth.The role played by chemerin during angiogenesis remains controversial. Pro-angiogenic, but often moderate effects of chemerin were reported. In this thesis, we investigated the role of chemerin on the neonatal development of the retinal vascular network in mice, a well-established model. We used for this purpose a mouse line allowing the controlled overexpression of a bioactive form of chemerin in keratinocytes, which results in a significant increase of chemerin bioactivity in the whole body. We observed in these mice a reduction in the density of the retinal vascular network from day 6 after birth and this phenotype persisted to adulthood. The extension of the network was however not affected, nor the proliferation of endothelial cells or the number of tip cells. There was rather an increase in the number of empty sleeves and of apoptotic endothelial cells, pointing towards an increase in vessel regression during the remodeling phase of the angiogenesis process. These anti-angiogenic effects of chemerin are mediated by CMKLR1, as they were abrogated in CMKLR1 knock-out mice. The anti-angiogenic effects of chemerin were confirmed in a model of oxygen-induced retinopathy, as well as in the hind limb ischemia model, and indications of vascular regression were also found in tumor grafts. A PTEN/AKT/FOXO1 pathway was identified as mediating the effects of chemerin on endothelial cells.Chemerin binds to three receptors, CMKLR1, GPR1 and CCRL2. The role of CCRL2 in angiogenesis remains largely unknown. We demonstrated that mice invalidated for CCRL2 display a reduction of the retinal vascular network similar to that observed in chemerin-overexpressing mice. This phenotype seems to be due to an increase in blood chemerin levels. Following the identification of chemerin as a negative regulator of angiogenesis, we investigated the consequence of chemerin overexpression in lymphangiogenesis. We demonstrated that lymphangiogenesis and lymph node metastasis was not affected in chemerin-overexpressing mice.Taken together, the experiments presented in this thesis suggest that the anti-angiogenic and anti-tumoral effects of chemerin may qualify the chemerin/CMKLR1 system as a potential therapeutic target for future anti-cancer therapies, but also for diseases in which excessive angiogenesis contribute to the pathogenesis. In this frame, the expression of the non-signaling chemerin receptor CCRL2 should be considered.L'angiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir des vaisseaux préexistants. L'établissement d'un réseau de vaisseaux sanguins fonctionnels est initié par la formation d'un plexus vasculaire primitif, à partir duquel de nouveaux vaisseaux sanguins se développent de manière coordonnée et se ramifient. Les branches de vaisseaux redondantes sont ensuite sélectivement supprimées par régression des vaisseaux, un processus appelé élagage.La chémérine est une protéine multifonctionnelle initialement caractérisée par le laboratoire hôte comme un facteur chimioattractant pour certaines populations de leukocytes. Son principal récepteur fonctionnel est ChemR23/CMKLR1. Notre groupe a identifié un mécanisme original par lequel la chémérine retarde la progression tumorale, en inhibant la vascularisation efficace des tumeurs et leur croissance. Le but de mon projet de thèse est d'étudier plus précisément comment la chémérine affecte l’angiogenèse, in vitro et in vivo, en utilisant un ensemble de modèles génétiques établis ou nouvellement développés chez la souris. Dans l'ensemble, nous visons à valider le système chémérine comme cible thérapeutique dans le cadre du cancer humain. Nous avons démontré que les souris surexprimant la chémérine développent en effet un réseau vasculaire rétinien moins dense, et cette particularité perdure jusqu’à l’âge adulte. Nous avons pu déterminer que ce n’est pas la formation du réseau qui est affectée, mais bien la stabilité des néovaisseaux lors de la phase de maturation de ce réseau. Il en résulte une nette augmentation de l’apoptose des cellules endothéliales et une régression accrue de segments vasculaires du réseau. L’expression de chémérine protège partiellement de l’angiogenèse excessive observée dans un modèle de rétinopathie, réduit le temps de récupération de la perfusion suite à la ligature de l’artère fémorale et perturbe distribution de collagène de type IV autour des cellules endothéliales, signe d’un manque de maturation et de l’instabilité de ces vaisseaux.Enfin, nous avons étudié les cascades de signalisation impliquées dans ces effets anti-angiogéniques. Par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques, nous avons mis en évidence, en réponse à la chémérine, une augmentation de l’activité de PTEN, une diminution de l’activité de la cascade PI3K/AKT et une augmentation de l’activité du facteur de transcription FOXO1, un régulateur bien connu du métabolisme et de la survie des cellules endothéliales.La chémérine se lie à trois récepteurs, CMKLR1, GPR1 et CCRL2. Il a été démontré qu’uniquement CMKLR1 et GPR1 induisaient une signalisation en aval après leur liaison à la chémérine. CCRL2 est exprimé sur plusieurs types cellulaires et son expression est rapidement augmentée suite à des stimuli inflammatoires. Cependant, son rôle dans l'angiogenèse reste largement méconnu. Nous avons démontré que les souris invalidées pour CCRL2 présentent une réduction du réseau vasculaire rétinien similaire à celle observée chez les souris surexprimant la chémérine. Ce phénotype semble être dû à une augmentation des taux sanguins de chémérine.Suite à l'identification de la chémérine comme régulateur négatif de l'angiogenèse, nous avons étudié la conséquence de la surexpression de la chémérine dans la lymphangiogenèse. Nous avons démontré que la lymphangiogenèse et les métastases ganglionnaires n'étaient pas affectées chez les souris surexprimant la chémérine.Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent que les effets anti-angiogéniques et antitumoraux de la chémérine pourraient qualifier le système chémérine/CMKLR1 comme une cible thérapeutique potentielle pour de futures thérapies anticancéreuses, mais aussi pour des maladies dans lesquelles une angiogenèse excessive contribue à la pathogenèse. Dans ce contexte, l'expression du récepteur non-signalant de la chémérine CCRL2 doit être prise en compte.Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)