Biophysical and structural characterization of transfer proteins from the conjugative plasmid pIP501 : novel insights in gram-positive conjugation

Horizontaler Gentransfer ist mitunter eine der Hauptursachen für die Aufrechterhaltung der Plastizität prokaryotischer Genome und hat erheblichen Anteil an der evolutionären Anpassungsfähigkeit von Bakterien. Die verstärkte Verbreitung Antibiotika resistenter Stämme, welche eine ernsthafte Gefahr für die menschliche Gesundheit darstellen, kann auf den lateralen Austausch spezifischer DNA-Abschnitte zurückgeführt werden. Der wichtigste Mechanismus ist dabei der konjugative Transfer von DNA über einen in der bakteriellen Membran gebunden Proteinkomplex. Diese Komplexe werden auch als Typ IV Sekretionssysteme (T4SS) bezeichnet und wurden bisher fast ausschließlich in Gram-negativen Bakterien erforscht. Dies überrascht umso mehr, da viele Humanpathogene der Klasse der Gram-positiven Vertreter zuzuordnen sind. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen und strukturellen Charakterisierung von Proteinen, welche von dem Gram-positiven konjugativen Plasmid pIP501 kodiert werden. Die Transferregion des Plasmids ist in Form eines einzelnen Operons organisiert, welches die genetische Information für fünfzehn Proteine umfasst. Drei dieser Proteine zeigen signifikante Ähnlichkeiten zu Proteinen welche bereits in Gram-negativen Systemen identifiziert wurden. Im Zuge der Arbeit wurde das Protein TraH hinsichtlich seiner funktionellen Beteiligung am Gesamtkomplex untersucht und dessen Struktur wurde mittels NMR-Spektroskopie in Lösung bestimmt. Das Transferprotein TraK wurde mit Hilfe eines biochemischen Ansatzes hinsichtlich seiner Topologie in der bakteriellen Zellmembran und seiner Oberflächenzugänglichkeit untersucht. Darüber hinaus wurde die Verwendung eines alternativen Startcodons über genetische Manipulation des Leserahmens und weiterführenden Expressionsstudien bewiesen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die vorliegende Arbeit zu einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen Gram-positiver Konjugation beitragt.Horizontal gene transfer significantly contributes to prokaryotic genome plasticity and the evolutionary adaption of bacteria to dynamic environmental conditions. Lateral exchange of genetic information has been identified as the main cause of a perpetual increase of antibiotic resistant strains posing a serious threat to human healthcare in the 21st century. In this respect, conjugative DNA transfer represents the most important dissemination pathway in bacterial species. The transmission of genes is mediated by a multiprotein complex known as type IV secretion system (T4SS). The core of a T4SS is large enough to span the entire cell envelope and thereby serves as a channel for macromolecular secretion. The underlying molecular mechanisms have been extensively studied in Gram-negative bacteria while Gram-positive species received only little attention so far. This Ph.D. thesis focused on the functional and structural characterization of transfer proteins derived from the Gram-positive broad-host range plasmid pIP501. The transfer region of pIP501 is organized in a single operon encoding fifteen proteins of which three were shown to be similar to T4SS components of Gram-negative origin. In the course of this work, the transfer factor TraH was extensively studied towards the putative function in the conjugative conduit and its solution structure was solved by NMR spectroscopy. The membrane-anchored transfer protein TraK was studied applying a biochemical approach. The topology in the bacterial membrane and surface accessibility were evaluated. Furthermore, utilization of an alternative translation initiation site was confirmed by genetic manipulation and expression studiesIn conclusion, data presented in this work will contribute to a better understanding of Gram-positive conjugation in general and pIP501-mediated transfer in particular.vorgelegt von Christian Fercher, BSc., MSc.Zusammenfassung in deutscher SpracheKarl-Franzens-Universität Graz, Dissertation, 2016OeBB(VLID)149748