Determination of N-acylphosphatidylethanolamines by LC-MS

Lipide sind Hauptkomponenten der Zellmembran und dienen hauptsächlich der Energiespeicherung und Signaltransduktion. N-acylphosphatidylethanolamine (NAPE) sind dreifach acylierte Phospholipide und fungieren hauptsächlich als Vorbotenstoff für Anandamide. Aufgrund mangelnder Verfügbarkeit von kommerziell erhältlichen NAPE Verbindungen, welche zur Methoden Etablierung benötigt werden, wurden eigene NAPE Standards nach einer abgeänderten Steglich-Veresterung erfolgreich synthetisiert. Da NAPE nur in sehr geringen Konzentration auftreten, wurde eine Festphasenextraktion (SPE) entwickelt, welche dazu im Stande ist, interferierende Verbindungen (wie Phospholipide und Neutrallipide) vom Analyten erfolgreich abzutrennen. Es konnte eine entsprechende massenspektrometrische Methode (MS), gekoppelt mit einer Umkehrphasen Flüssigchromatographie (RP), zur qualitativen und quantitativen NAPE Bestimmung etabliert werden, welche dazu im Stande ist, einzelne NAPE Verbindungen erfolgreich voneinander zu separieren. Mithilfe der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) Technik konnte eine Multiple Reaction Monitoring (MRM) Methode basierend auf charakteristischen N-Acyl Fragmenten generiert werden. Des Weiteren wurde der Matrix Einfluss von Rattenhirn Proben bezüglich potentiell auftretender Ionen Suppression untersucht. Mithilfe einer hochauflösenden MS konnte diese Vermutung für bestimmte NAPE Verbindungen bestätigt werden. Zusätzlich zeigten die Proben, welche eine Festphasenextraktion durchlaufen hatten, einen geringeren Ionen Suppressionseffekt, vermutlich aufgrund erfolgreicherer Eliminierung von störenden Matrixbestandteilen. Die optimierten Methoden der SPE sowie der RP-MS/MS wurden an Rattenhirn-Proben angewandt. Es konnten 62 verschiedene NAPE-Verbindungen quantifiziert werden, welche einen Gesamtkonzentrationsbereich von etwa 9.26 nmol/g Rattenhirn ausmachen.In biological systems,lipids play an important role in energy storage, as signal transducers and as membrane anchors. N-acylphosphatidylethanolamines (NAPEs) are triacylated phospholipids that act as precursors of N-acylethanolamines in mammalian tissues. As NAPE species are hardly commercially available, standards for method development were synthesised using a modified Steglich esterification. Special liquid-liquid extraction (LLE) and solid phase extraction (SPE) were performed on rat brain samples to increase sensitivity. The developed SPE method is capable of removing interfering compounds such as neutral lipids and phospholipids. An adequate Reversed Phase (RP) method for NAPE quantification was developed which is capable of separating NAPE compounds based on total chain length and degree of unsaturation while providing excellent peak shape. Besides various other techniques in lipid analysis, mass spectrometry has emerged as an essential tool for characterisation, identification and quantitation of lipids. Due to its sensitivity and selectivity,mass spectrometry including fragment ion information (MS/MS) is preferentially utilised,which is in this case the method of choice for qualitative and quantitative NAPE analysis. A multiple reaction monitoring (MRM) method using characteristic N-acyl fragments could be established. Additionally, the ion suppression or ion enhancement phenomena were analysed by high resolution mass spectrometer. The influence of matrix and gradient on the ionisation behaviour of selected NAPEs was investigated. Sample matrix effects causing ion suppression were experimentally confirmed,but the SPE prevent a noticeable part of ion suppression impact, as it contains less matrix amount due to more successful matrix elimination performance. The developed SPE and RP-MS/MS methods were applied to rat brain samples. A number of 62 different NAPE species were quantified which represent a total NAPE content of approximately 9.26 nmol/g rat brain.Sabrina WeissengruberZsfassungen in dt. und engl. SpracheGraz, Univ., Masterarb., 2015(VLID)48201