Physiological and Metabolic Consequences of Expression Vector Presence in Escherichia coli

Escherichia coli er en av de mest brukte vertsorganismene for rekombinant proteinproduksjon, selv om bakterien har ulemper som kan redusere proteinutbytte. Ekspresjonsvektorer kan påføre produksjonsorganismen en metabolsk byrde, som kan føre til fysiologiske og metabolske konsekvenser. Disse konsekvensene kompliserer utviklingen og optimaliseringen av rekombinante bioprosesser. Den metabolske byrden ekspresjonsvektorer påfører produksjonsorganismen ble studert ved hjelp av rekombinant E. coli BL21 transformert med ekspresjonsvektorer med to forskjellige styrker av det induserbare XylS/Pm ekspresjonssystemet og to variasjoner i plasmidkopinumre. For de ulike kombinasjonene av ekspresjonsvektorstyrkene og plasmidkopinumrene studert var det en stamme som produserte reporterprotein mCherry og en kontrollstamme som manglet det mCherry-kodende genet. Batch kultiveringer i labskala bioreaktorer ble utført for å studere vekstegenskapene til de ulike stammene. Den ekstracellulære konsentrasjonen av substrat og produkter gjennom kultiveringen ble kvantifisert ved hjelp av høypresisjonsvæskekromatografi. Revers fase væskekromatografi-tandem massespektrometri ble brukt til å kvantifisere den intracellulære konsentrasjonen av aminosyrer og TCA syklus metabolitter for å studere hvordan ekspresjonsvektorene påvirket de intracellulære konsentrasjonene av metabolittene. Mikroskopering ble brukt til å sammenligne de cellulære lengdene mellom de ulike stammene. Resultatene demonstrerte at den metabolske byrden ekspresjonsvektorene påførte vertsorganismen førte til fysiologiske og metabolske konsekvenser. Det ble observert at den teoretiske mengden metabolsk byrde implisert av økende plasmidkopitall, styrke på ekspresjonssystemet og produksjon av reporterproteinet mCherry ble gjenspeilet i graden av fysiologiske og metabolske konsekvenser. De rekombinante stammene transformert med ekspresjonsvektorer med høy grad av teoretisk byrde hadde signifikant mer reduserte veksthastigheter og økt produksjon av overstrømningsmetabolitter etter induksjon sammenlignet med de andre stammene. Stammen som var transformert med ekspresjonsvektoren som hadde høyest grad av teoretisk metabolsk byrde ble observert til å ha høyest grad av fysiologiske og metabolske konsekvenser. Stammen hadde fullstendig vekststopp etter indusering av mCherry produksjon, redusert biomassekonsentrasjon, større grad av filamentøse celler, tilpasning av metabolismen mot energi produserende reaksjonsspor, og økte ekstracellulær konsentrasjon av overstrømmingsmetabolittene eddiksyre og melkesyre