Breeding of Arbutus unedo L.: use of convencional and biotechnological tools to obtain tolerant genotypes against abiotic and biotic stresses

Tese de Doutoramento em Biociências, especialização em Biotecnologia, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Arbutus unedo L. (medronheiro, Ericaceae) é uma árvore perene com uma distribuição circum-mediterrânica. Devido à sua resiliência a stresses abióticos e bióticos, tem grande relevância ecológica nas florestas do sul da Europa. As suas bagas vermelhas são comestíveis e usadas na produção de produtos tradicionais, incluindo um destilado de grande valor económico. Além disso, diversos compostos com atividade biológica têm sido usados na indústria farmacêutica e cosmética. De uma espécie negligenciada, o medronheiro tem vindo gradualmente a converter-se numa espécie de grande valor, com uma crescente área de plantação. Devido ao aumento da procura de plantas com características melhoradas por parte dos produtores, a implementação de um programa de melhoramento para a espécie é crucial. Apesar da intensa atividade de investigação realizada nos últimos anos em medronheiro, existem ainda muitas lacunas no conhecimento que terão de ser preenchidas, tais como o conhecimento da biologia da planta, otimização de protocolos de propagação e dos mecanismos por detrás da resistência aos stresses abiótico e biótico do medronheiro. Assim, três linhas principais de investigação foram seguidas nesta tese: i) desenvolvimento e otimização de protocolos de micropropagação (embriogénese somática, proliferação de meristemas e organogénese em meio líquido), avaliação da capacidade de tolerância ao stress hídrico das plantas micropropagadas e estudo do microbioma das plantas in vitro; ii) estudo da biologia reprodutiva, cruzamento e seleção de genótipos resistentes ao stress hídrico, e estudo dos mecanismos de tolerância em condições de stress hídrico; e iii) caracterização do microbioma, caracterização química, e a sua relevância na defesa da planta. A indução de embriogénese somática revelou-se particularmente eficaz com 2 mg L-1 de 6-benzilaminopurina (BAP) e 2 mg L-1 de ácido 1-naftalenoacético (NAA), com taxas de indução de 97,22% ± 4,81. No entanto, as taxas de indução variam em função do genótipo. Apesar de a fase de indução ser eficaz, a conversão de embriões em plantas é ainda limitada, o que poderá estar relacionado com a ocorrência de anomalias. A proliferação de meristemas em meio líquido revelou-se um método bastante eficaz assim como através de organogénese. Apesar de apresentaram sinais de vitrificação, as plantas recuperam o seu fenótipo normal e a sua performance em stresse hídrico, avaliada através de parâmetros fisiológicos, não é afetada. No que diz respeito à análise do microbioma, 79 géneros de bactérias pertencentes a 7 filos e apenas um género de Archaea foram identificados. O filo Actinobacteriota foi o mais abundante e diverso (48%), seguido pelo filo Proteobacteria (43%). Foram encontradas diferenças entre genótipos na composição do microbioma nas plantas in vitro. No entanto, essas diferenças diluíram-se quando as plantas foram aclimatizadas e um aumento significativo de diversidade foi igualmente observado. Um estudo morfológico das estruturas reprodutoras e da fenologia da planta permitiu a realização de cruzamentos controlados e obtenção de híbridos, que quando submetidos a condições de défice hídrico revelarem grande plasticidade fenotípica. Além da importância do genótipo na tolerância ao stresse hídrico, verificou-se que a proveniência das plantas poderá também ter a sua contribuição. Este trabalho confirma o fato de o medronheiro apresentar um comportamento tipicamente isohídrico em condições de stresse hídrico, através de um rigoroso controlo dos estomas. Um perfil metabólico específico foi encontrado num genótipo tolerante e várias hormonas chave (e.g., ácido abscísico e salicílico) mostraram estar regulados positivamente em plantas sob stresse hídrico. No que diz respeito à comunidade de endófitos cultivável, foram isoladas e identificadas diversas espécies de fungos (e.g., Aureobasidium pullulans e Trichoderma atroviride) e bactérias (ex. Bacillus cereus e Paenibacillus humicus). Alguns destes microrganismos produzem várias enzimas, tais como celulases e proteases, sideróforos, e outros compostos que podem desempenhar um papel essencial nos mecanismos de defesa da planta e reduzir o efeito dos mais relevantes patógenos do medronheiro, entre eles Phytophthora cinnamomi. Em particular, Trichoderma atroviride e Bacillus cereus revelaram ser antagonistas de vários fitopatógenos. Finalmente, através de análises químicas, foram identificados 54 compostos na folha, e o perfil químico mostrou variações entre genótipos e também sazonais. O extrato foliar da planta, assim como alguns compostos fenólicos isolados (arbutina e hidroquinona), mostraram ter atividade antifúngica, o que revela um complexo e intrincado mecanismo de defesa contras patógenos. Na sua globalidade, este trabalho interdisciplinar, realizado com a colaboração de diferentes laboratórios, representa um considerável avanço no conhecimento sobre a biologia de A. unedo. Assim, foi possível otimizar protocolos de micropropagação, compreender aspetos relacionados com a reprodução sexuada, analisar o papel de metabolitos secundários em termos de resposta ao stresse e perceber a interação da espécie com microrganismos. Além disso, os resultados obtidos abriram também caminho para novas linhas de investigação que poderão ajudar a promover a fileira do medronho e tornar ainda mais percetível a passagem desta espécie de negligenciada a espécie de interesse agrícola, especialmente em zonas onde outras espécies arbóreas ou arbustivas são difíceis de cultivar. As áreas de investigação consideradas prioritárias no futuro são também destacadas, tais como a seleção de plantas, o desenvolvimento de métodos rápidos de seleção através de marcadores metabólicos, a avaliação da introdução de endófitos em plantas produzidas em viveiro ou diretamente no campo, assim como o desenvolvimento de projetos de sequenciação genómica que permitam realizar estudos de biologia fundamental e a seleção com base em marcadores genómicos.Arbutus unedo L. (strawberry tree, Ericaceae) is a perennial tree with a circum-Mediterranean distribution. It has a great ecological relevance in south Europe forests due to its resilience against abiotic and biotic stresses. The edible red berries are used in the production of traditional products, including a high-value spirit. Furthermore, several compounds with bioactive properties have been used by the cosmetic and the pharmaceutical industries. From a neglected species, strawberry tree has been gradually converted into a high valuable crop with an increased cultivation area in Southern European and Northern African countries. Due to an increasing demand for plants with improved features by farmers and other stakeholders, it is crucial to establish a breeding program for this species. Despite the intense research activity carried out in recent years in strawberry tree, some major knowledge gaps still need to be filled, such as our understanding of plant biology, optimization of propagation protocols and the mechanisms behind abiotic and biotic stress resistance. Thus, three main lines of investigation were followed in this thesis: i) development and optimization of micropropagation protocols (somatic embryogenesis, shoot proliferation and organogenesis in liquid medium), evaluation of the water stress tolerance capacity of micropropagated plants and study of the microbiome of plants in vitro; ii) study of reproductive biology, breeding and selection of genotypes resistant to water stress, and study of tolerance mechanisms under water stress conditions; and iii) microbiome characterization, chemical fingerprint, and their relevance for plant defence. Induction of somatic embryogenesis was particularly effective with 2 mg L-1 of 6-benzylaminopurine (BAP) and 2 mg L-1 of 1-naphthaleneacetic acid (NAA), with induction rates of 97.22% ± 4.81. However, induction rates vary depending on the genotype. Although the induction phase is effective, the conversion of embryos into plants is still limited, which could be related to the anomalies observed in several somatic embryos. The proliferation of meristems in liquid medium proved to be a very effective method as well as through organogenesis. Despite showing signs of hyperhydricity, the plants recover their normal phenotype and their performance under water stress, evaluated through physiological parameters, is not affected. Regarding the microbiome analysis, 79 bacterial genera belonging to 7 phyla and only one Archaea genus were identified. The phylum Actinobacteriota was the most abundant and diverse (48%), followed by the phylum Proteobacteria (43%). Differences between genotypes were found in the composition of the microbiome in plants in vitro. However, these differences were diluted when the plants were acclimatized and a significant increase in diversity was also observed. A morphological study of the reproductive structures and of the plant's phenology allowed the realization of controlled crossings and the obtainment of hybrids, which when subjected to conditions of water deficit reveal great phenotypic plasticity. In addition to the importance of the genotype in tolerance to water stress, it was found that the origin of the plants could also play an important role. This work confirms the fact that the strawberry tree presents a typical isohydric behaviour in water stress, through a rigorous control of the stomata and adds new scientific knowledge. A specific metabolic profile was found in the tolerant genotype and several key hormones (e.g., abscisic and salicylic acid) were up-regulated in plants under water stress. With regard to the cultivable endophyte community, several species of fungi (e.g., Aureobasidium pullulans and Trichoderma atroviride) and bacteria (e.g., Bacillus cereus and Paenibacillus humicus) were isolated and identified. Some of these microorganisms produce various enzymes, such as cellulases and proteases, siderophores, and other compounds that can play an essential role in the plant defence mechanisms and reduce the effect of the most relevant pathogens of strawberry tree, such as Phytophthora cinnamomi. In particular, Trichoderma atroviride and Bacillus cereus have been shown to be antagonists of several phytopathogens. Finally, through a chemical analysis, 54 compounds were identified in the leaf, and the chemical profile showed variations between genotypes and also seasonal. The plant leaf extract, as well as some isolated phenolic compounds (arbutin and hydroquinone) were shown to have antifungal activity, which reveals a complex and intricate defence mechanism against pathogens. Overall, this interdisciplinary work, carried out in collaboration with different laboratories, represents a considerable advance in the knowledge about the biology of A. unedo. Thus, it was possible to optimize micropropagation protocols, understand aspects related to sexual reproduction, analyze the role of secondary metabolites in terms of stress response and understand the interaction of the species with microorganisms. In addition, the results obtained also opened the way for new lines of research that could help to promote even further the conversion of this once neglected species into a plant of agricultural interest, especially in areas where other tree or shrub species are difficult to cultivate. Research areas considered to be priorities for the future are also highlighted, such as plant selection, the development of rapid selection methods using metabolic markers, the evaluation of the introduction of endophytes in nursery or directly on the field, as well as the development of genomic sequencing projects that allow for fundamental biology studies and selection based on genomic markers.ReNATURE (CENTRO-01-0145-FEDER-000007), co-financed by the Regional Operational Programme Centro 2020, Portugal 2020, and the European Union, through the European Regional Development Fund (ERDF)