Micropropagação de clones híbridos de Castanea sativa x C. crenata e C. sativa x C. mollissima para estudos de resistência a Phytophthora cinamomi

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal (Biotecnologia), apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Universidade de Coimbra.A Castanea sativa é uma espécie economicamente relevante para os países europeus, pela produção de madeira e fruto. No entanto a sua produção tem vindo a reduzir devido a suscetibilidade a determinados fungos. Medidas mitigadoras foram implementadas em 1945. Em 1957 iniciou-se o melhoramento genético através da hibridação com C. crenata. Em 2006 foram estabelecidos cruzamentos entre C. sativa x C. crenata e C. sativa x C. molíssima . O trabalho experimental desta tese teve como objetivo de micropropagação de 44 clones híbridos desses cruzamentos. Na fase de estabelecimento e multiplicação onde foram testados macronutrientes dos diferentes meios de cultura: Murashige&Skoog (MS); MS com macronutrientes reduzidos a metade (MS/2); Greshoff and Doy (GD); e Fossard (FS). Aos meios testados foram adicionados micronutrientes de Murashige and Skoog, vitaminas de Fossard e 0,087M de açúcar. Foi testada a adição de benzilaminopurina (BAP) nas concentrações: 0,45; 0,89 e 2,22 μM. No enraizamento e aclimatização testaram-se os seguintes métodos: 1) ex vitro – indução de enraizamento é por “Dipping”(imersão da base do rebento) (4,9 mM IBA; durante 15’’) em simultâneo com aclimatização; 2) in vitro two steps – indução de enraizamento in vitro em meio de cultura Knop (14,8 μM IBA; durante 7 dias), com posterior transferência para o mesmo meio base Knop adicionado CA 1% (durante 30 dias); 3) in vitro dipping – indução de enraizamento in vitro por “Dipping” (4,9 mM IBA; durante 15’’), com posterior transferência para o mesmo meio base Knop adicionado CA 1% (durante 30 dias). A aclimatização foi realizada em caixas de polietileno de plástico transparente contendo perlite. Após quatro semanas as plantas foram transferidas para vasos. Os melhores resultados observados durante a fase de estabelecimento foram obtidos com BAP 0,89μM. De 44 clones híbridos foram estabelecidos 30 clones. Os meios FS e MS/2 com BAP 0,45μM mostraram melhores resultados na fase de multiplicação. A formação de callus, vitrificação e clorose mostraram ser consequências do fator genótipo Clone. O enraizamento ex vitro em simultâneo com a aclimatização mostrou ser o mais eficaz dos procedimentos.The production of fruit and wood sets Castanea sativa as an economically important species for the European countries. However, its production has been decreasing due to the susceptibility to certain fungi. Mitigating measures were implemented in 1945. Later, in 1957, genetic breeding was initiated through hybridization with C. Crenata. In 2006, crosses between C. sativa x C. crenata e C. sativa x C. Molíssima were established. The experimental work of this thesis aimed to start the micropropagation of 44 hybrid clones of these crossings. At the stage of establishment and multiplication, the following macronutrients of different culture media were tested: Murashige&Skoog (MS); MS with half of the macronutrients (MS/2); Greshoff and Doy (GD); and Fossard (FS). Murashige and Skoog micronutrients, Fossard vitamins and 0.087M sugar were added to the tested media. Benzilaminopurin (BAP) addition was tested in three different concentrations: 0,45; 0,89 and 2,22 μM. In the rooting and acclimatization phases the following methods were tested: 1) ex vitro - rooting by dipping induction (immersion of the shoot base) (IBA 4.9 mM; during 15'') simultaneously with acclimatization, 2) in vitro two steps – in vitro rooting induction with culture medium Knop (14.8 mM IBA, for 7 days) followed by the same basal medium Knop with addition of CA 1% (30 days) 3) in vitro dipping - rooting induction by in vitro dipping (IBA 4.9 mM; during 15''), and subsequent transfer to the same basal medium Knop with 1% CA (for 30 days). Acclimatization was carried out in transparent polyethylene plastic boxes containing perlite. Four weeks later the plants were transferred to pots. The most positive results were observed during the establishment phase using 0.89 mM BAP. 30 of the 44 hybrid clones were established. MS and MS/2 culture media with 0.45 mM BAP showed better results in the multiplication phase. The formation of callus, glazing and chlorosis shown to be consequences of the Clone genotype factor. The ex vitro rooting with the acclimatization proved to be the most effective procedures