Síntese e screening de derivados de um composto natural com atividade anti-inflamatória

Dissertação de Mestrado em Farmacologia Aplicada apresentada à Faculdade de FarmáciaO envelhecimento é o fator de risco predominante para a maioria das doenças crónicas que condicionam a esperança de vida com saúde. Uma vez que a incidência e a prevalência de várias doenças crónicas continuam a aumentar, são necessárias intervenções que permitam aumentar a expectativa de vida saudável e retardar o envelhecimento.Apesar de bastante diferentes, todas as doenças crónicas têm um mecanismo fisiopatológico em comum – a ocorrência de inflamação crónica de baixo grau que contribui para a morbilidade e mortalidade que lhes estão associadas. A inflamação crónica de baixo grau é uma resposta persistente, de baixa intensidade e clinicamente pouco evidente, mas que pode ser detetada pelo aumento dos níveis de citocinas, quimiocinas, prostaglandinas, óxido nítrico (NO), entre outros mediadores inflamatórios, tanto no plasma como nos tecidos. As atuais terapias disponíveis para as doenças crónicas relacionadas com o envelhecimento são apenas sintomáticas, e não alteram o curso das mesmas. Têm sido feitos esforços para alargar a janela de benefício-risco das terapias anti-inflamatórias para as doenças crónicas, visto que a comunidade científica tem investigado novas classes de medicamentos que poderão ser capazes de travar/retardar os processos inflamatórios relacionados com estas doenças. Os compostos de origem natural têm sido tradicionalmente utilizados em diversas patologias e reemergiram recentemente devido à sua diversidade e largo espetro de benefícios. Os produtos naturais têm sido uma fonte de inspiração no desenvolvimento da química medicinal, proporcionando avanços nas metodologias sintéticas e semi-sintéticas e a possibilidade de criar análogos de compostos lead, com melhores características farmacológicas e/ou farmacêuticas, com base em estudos de Relação Estrutura-Atividade (REA).Neste projeto, o nosso principal objetivo focou-se no design e na síntese de derivados do CIAD7, um composto natural com propriedades anti-inflamatórias, e na avaliação da atividade anti-inflamatória dos mesmos. Foram sintetizados e purificados 10 derivados do CIAD7, posteriormente confirmando as suas estruturas químicas. Quatro dos compostos obtidos foram avaliados quanto à sua citotoxicidade e efeitos anti-inflamatórios.Para tal, os derivados do CIAD7 foram testados quanto à sua capacidade para inibir a produção de NO induzida pela IL-1β através do ensaio de Griess, e foram também avaliados os seus efeitos nos níveis de proteína de iNOS e IL-1β por Western Blot. Os efeitos anti-inflamatórios destes compostos foram estudados numa linha celular de macrófagos murinos (Raw 264.7) que foi estimulada com lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias Gram-negativas para induzir uma resposta inflamatória.Os ensaios de viabilidade mostraram que as concentrações selecionadas dos compostos testados não apresentaram efeitos citotóxicos. De facto, nenhuma das concentrações testadas apresentou efeitos citotóxicos na presença de LPS para todos os compostos avaliados. Os resultados obtidos confirmaram que todos os compostos testados têm a capacidade de reduzir os níveis de iNOS e de produção de NO, induzidos pelo LPS, de uma forma dependente da concentração. No entanto, os compostos demonstraram diferenças significativas relativamente à sua potência para inibir a produção de NO. O composto GM23 foi considerado o mais potente (IC50= 436,5 µM), seguido do seu enantiómero, GM22 (IC50= 521,8 µM) e com potências bastante mais baixas, os compostos GM16f1 (IC50= 1010 µM) e GM2 (IC50= 1046 µM).Este estudo abre portas para futuros estudos in vitro com o objetivo de compreender totalmente os efeitos anti-inflamatórios dos compostos testados e os mecanismos subjacentes, podendo assim determinar se as modificações químicas introduzidas na molécula do CIAD7 têm alguma vantagem em relação ao composto original.Aging is the predominant risk factor for most chronic diseases that limit health span. As the incidence and prevalence of several chronic diseases continue to rise, interventions to increase healthy life expectancy and to delay aging are necessary. Despite being very different, all chronic diseases have a pathophysiological mechanism in common – the occurrence of a low-grade chronic inflammation state – the occurrence of a low-grade chronic inflammation state, which contributes to their morbidity and mortality. This state is characterized by a low-grade persistent inflammatory response that frequently is not clinically evident, but can be detected by the presence of increased levels of cytokines, chemokines, prostaglandins, nitric oxide (NO), and other inflammatory mediators both in plasma and in tissues. The current available therapeutics for inflammatory age-related diseases are only capable of reducing the symptoms related to the disease, and do not alter its course. Efforts are being made to widen the benefit-to-risk window of anti-inflammatory therapy in chronic diseases, as researchers are seeking for new classes of drugs that may be capable to stop/retard the inflammatory process related to these diseases.Compounds of plant origin have traditionally been used against several pathologies and have recently emerged due to their diversity and large specter of benefits. Natural products have inspired many developments in medicinal chemistry, leading to advances in synthetic and semi-synthetic methodologies and to the possibility of making analogues of the original lead compounds, with improved pharmacological and/or pharmaceutical properties, based on Structure-Activity Relationship (SAR) studies.In this project, our main goal was to design and synthetize chemical derivatives of CIAD7, a natural compound with anti-inflammatory properties, and evaluate their anti-inflammatory activity. Ten chemical derivatives of CIAD7 were synthesized, purified and their chemical structures confirmed. Four of the compounds obtained were then tested for anti-inflammatory effects and cytotoxicity. For that, CIAD7 derivatives were evaluated for the capacity to inhibit IL-1β-induced NO production by the Griess assay, and also their effects on iNOS and pro-IL-1β protein levels by Western Blot. The anti-inflammatory properties of these compounds were studied in a mouse macrophage cell line (Raw 264.7) that was stimulated with lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria to induce the inflammatory response.Viability assays showed that the chosen concentrations of the tested compounds were safe and did not present cytotoxic effects. In fact, none of the concentrations tested for all the evaluated compounds had cytotoxic effects in the presence of LPS.The obtained results confirmed that all the test compounds are able to reduce LPS-induced iNOS protein levels and NO production in a concentration-dependent manner. Nonetheless, these compounds show significant differences in potency relative to their ability to inhibit NO production. GM23 was found to be the most potent (IC50= 436.5 µM), followed by its enantiomer, GM22 (IC50= 521.8 µM) and with much lower potencies, by GM16f1 (IC50= 1010 µM) and GM2 (IC50= 1046 µM).This study paves the way for further in vitro studies aimed at fully understanding the anti-inflammatory effects of the tested compounds and the underlying mechanisms and determining whether the chemical modifications of CIAD7 introduced have any advantages over the parent compound