Evaluation of therapeutic response biomarkers for lung cancer: in vitro studies

Dissertação de Mestrado em Farmacologia Aplicada apresentada à Faculdade de FarmáciaLung cancer worldwide is a major cause of mortality. Pathologically, lung cancer is a heterogeneous disease, classically divided into two main categories, namely NSCLC (non-small cell lung cancer) and SCLC (small cell lung cancer). NSCLC represent 85% of malignant lung cancer and are subdivided into three categories: adenocarcinoma, squamous cell carcinoma and large cell carcinoma. The therapeutic option chosen for the treatment of any type of cancer is always dependent on the stage of the tumour at the diagnosis and on its biological characteristics. In lung cancer, this decision is a substantial challenge, since most of the patients are diagnosed at advanced stages, with a 5-years survival estimate. Thus, constant research in an area of intervention as important as cancer is unquestionably necessary. One of these areas is metabolomics, defined as the study of biological processes involving low molecular weight compounds (metabolites), present in cells or organisms, which participate in the maintenance of cellular functions. The main objective of this research project is to understand the altered metabolism of NSCLC cell lines, using metabolomics. Thus, it is intended to study changes in the metabolomic profile after different treatment regimens, namely after exposure to drugs regularly used in clinical practice within classic QT regimens (carboplatin/cisplatin) in which these are used in combination with pemetrexed and gemcitabine. In immunotherapy, namely ICPIs (immune checkpoint inhibitors) such as nivolumab and pembrolizumab, to reveal potential biomarkers.The first part of this work included the characterization of two lung cancer tumour cell lines (A549 and H1299) in terms of morphological and immunohistochemical characterization.Subsequently, the effect of different drugs and their combinations was evaluated on cell proliferation, using the study metabolic activity, through MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. The second part of this work aimed to quantify intra or intercellular metabolites in view of the exposure of cells to different therapies using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Finally, to support the study of metabolomics, cell viability and the profile of cell death caused by the different therapeutic approaches studied were evaluated, using double labelling with annexin V and propidium iodide by flow cytometry. The characterization of the cell lines showed that H1299 cell line is representative of large cell carcinoma and A549 cell line is representative of adenocarcinoma. Both cell lines do not express the PD-L1 receptor (Programmed death ligand 1), so studies with ICPIs, namely nivolumab and pembrolizumab, were not followed up, as their mode of action is dependent on this receptor. The drugs and combinations, which showed greater anti-proliferative activity in the H1299 cell line, were cisplatin associated with gemcitabine. In the A549 cell line, it can be concluded that cisplatin administered alone showed greater anti-proliferative activity. Thus, the association between cisplatin and gemcitabine is seen as an excellent candidate for combination therapy, as it is associated with moderate side effects and toxicity is dependent on the dose administered. The study of cell viability did not verify that there was only a decrease of approximately 10% of viable cells, without compromising the metabolomic analysis. The technique of spectroscopy by nuclear magnetic resonance allows quantifying several metabolites and obtaining the metabolic profile of cells after exposure to different chemotherapeutic treatment regimens. In addition to the existing constraints due to the pandemic, technical issues associated with a failure in the nuclear magnetic resonance equipment in which these samples would be analyzed hampered the obtaining of the metabolomics results. Thus, the continuity of this work comprises the quantification of the metabolites present in the samples of the cell lines under study and subsequent identification of possible biomarkers in vitro and the translate this preclinical study into a clinical study, whose main objective is to validate the identification of these biomarkers in biofluids, in order to understand if they could be considered specific biomarkers for lung cancer.O cancro do pulmão, a nível mundial, constitui uma das principais causas de mortalidade. Em termos patológicos o cancro do pulmão é uma doença heterogénea, classicamente dividida em duas categorias principais, os NSCLC (do inglês, non-small cell lung cancer) e os SCLC (do inglês, small cell lung carcinoma). Os NSCLC, representam cerca de 85% das neoplasias malignas do pulmão e subdividem-se em três subcategorias: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de grandes células. A opção terapêutica recomendada para o tratamento de qualquer tipo de cancro é sempre condicionada pelo estádio em que se encontra o tumor no momento do diagnóstico e pelas características biológicas do mesmo. No cancro do pulmão esta tomada de decisão torna-se um desafio ainda mais substancial, já que a maioria dos doentes são diagnosticados em estádios avançados, estimando-se uma sobrevida de 5 anos. A investigação constante, numa área de intervenção tão importante como o cancro, é inquestionavelmente necessária. Uma dessas áreas é a metabolómica, definida como o estudo de processos biológicos envolvendo compostos de baixo peso molecular (metabolitos), presentes em células ou organismos, que participam na manutenção das funções celulares.O principal objetivo deste projeto de investigação foi compreender as alterações do metabolismo de células de linhas de cancro do pulmão do tipo não pequenas células, com recurso à metabolómica. Pretendemos estudar as alterações no perfil metabolómico após diferentes regimes de tratamento, nomeadamente após exposição a fármacos utilizados regularmente na prática clínica nos regimes clássicos de quimioterapia (QT) (carboplatina/cisplatina) em que estes são usados em combinação com o pemetrexede e a gemcitabina. Na imunoterapia, nomeadamente os ICPIs (do inglês immune checkpoint inhibitors), tais como o nivolumab e o pembrolizumab, foram igualmente alvo de estudo, a fim de tentar revelar potenciais biomarcadores.A primeira parte do trabalho consistiu na caracterização de duas linhas celulares tumorais de NSCLC (A549 e H1299) em termos de morfologia e de imunocitoquímica. Posteriormente, avaliou-se o efeito dos diferentes fármacos e suas combinações, na proliferação celular, recorrendo ao estudo da atividade metabólica, por espetrofotometria, através do ensaio MTT ( do inglês, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide).A segunda parte deste trabalho teve como objetivo quantificar os metabolitos intra ou intercelulares, face à exposição das células às diferentes terapias, com recurso à espetroscopia por ressonância magnética nuclear. Por último, para apoiar o estudo da metabolómica, foram avaliadas a viabilidade celular e o perfil de morte celular provocadas pelos diferentes regimes terapêuticos, com recurso à dupla marcação com anexina V e iodeto de propídeo, através da técnica de citometria de fluxo.A caracterização das linhas celulares mostrou que a linha celular H1299 é representativa do carcinoma de grandes células e a linha celular A549 é representativa de adenocarcinoma. Ambas as linhas celulares não expressam o recetor PD-L1 (do inglês, Programmed death ligand 1) pelo que não foi dado seguimento aos estudos com os ICPIs, nivolumab e pembrolizumab, visto o seu mecanismo de ação estar na dependência deste recetor. Os fármacos e as combinações que revelaram maior atividade anti-proliferativa na linha celular H1299 foram a cisplatina associada à gemcitabina. Por outro lado, na linha celular A549, concluiu-se que a cisplatina administrada isoladamente foi a que apresentou maior atividade anti-proliferativa. Assim, a associação entre a cisplatina e a gemcitabina é um excelente candidato à terapia combinada, pois está associada a efeitos adversos moderados e a toxicidade está dependente da concentração administrada.O estudo da viabilidade celular permitiu-nos verificar que apenas houve uma diminuição de aproximadamente 15% de células viáveis, não comprometendo a análise metabolómica.A técnica de espetroscopia por ressonância magnética permite quantificar diversos metabolitos e obter o perfil metabolómico das células após exposição a diferentes regimes de tratamento quimioterapêuticos. Além dos constrangimentos existentes devido à pandemia, questões técnicas associadas a uma avaria no equipamento de ressonância magnética nuclear, no qual estas amostras seriam analisadas, impediram a obtenção dos resultados da análise metabolómica. Assim, a continuidade deste trabalho prende-se com a quantificação dos metabolitos presentes nas amostras das linhas celulares em estudo e posterior identificação de possíveis biomarcadores in vitro, como também a translação deste estudo pré-clínico para um estudo clínico, cujo principal objetivo consiste na validação da identificação desses biomarcadores em biofluídos, de forma a perceber se poderão efetivamente ser considerados biomarcadores específicos para o cancro do pulmão