Liquid biopsies for cancer detection and monitoring

Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaAs biópsias líquidas consistem na análise de material tumoral, nomeadamente DNA tumoral em circulação (ctDNA), obtido de forma minimamente invasiva a partir do sangue ou de outros biofluidos. Em doentes com cancro, o ctDNA pode ser usado para estabelecer o perfil molecular tumoral. Variações na sua concentração podem ser um indicador da carga tumoral, estádio e resposta à terapia. Assim, o primeiro objetivo deste projeto consistiu na correlação das alterações dinâmicas dos níveis plasmáticos de DNA livre em circulação (cfDNA) em doentes com cancro, nomeadamente gliomas e cancro oral, antes e durante o tratamento, com as suas características clínicas.Além disso, o cancro caracteriza-se pela instabilidade (epi)genómica. Compreender as alterações moleculares subjacentes ao desenvolvimento e progressão do cancro pode melhorar o diagnóstico, prognóstico e o tratamento dos doentes. Consequentemente, foi também objetivo deste trabalho, identificar os genes mais frequentemente alterados nestes doentes, através da caracterização genómica e epigenética do tecido tumoral antes de qualquer tratamento, de forma a estabelecer possíveis biomarcadores de diagnóstico e prognóstico.Atendendo aos objetivos deste projeto, foram colhidas um total de 33 amostras de tecido tumoral e macroscopicamente livre de tumor e 81 amostras de biofluidos (sangue) de 21 doentes diagnosticados com cancro oral e gliomas. A primeira colheita das amostras de tecido tumoral e plasma (sangue) ocorreu antes de qualquer tratamento. Durante o tratamento, foi colhido sangue em momentos clínicos específicos. O cfDNA total isolado do plasma foi quantificado. A caracterização genómica e epigenética do tecido tumoral foi realizada por array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) e Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MS-MLPA), respetivamente.Em relação à análise quantitativa do cfDNA, os doentes apresentaram, em média, concentrações plasmáticas de cfDNA no pré-operatório mais elevadas do que o grupo controlo. Nos doentes com cancro oral, após o primeiro tratamento, verificou-se um aumento nos níveis de cfDNA que, posteriormente, tenderam a diminuir.As principais variações do número de cópias (CNVs) detetadas por MS-MLPA no tecido tumoral dos doentes com cancro oral foram perdas nos genes CDKN2A, VHL e STK11 e ganhos nos genes MLH3, PAX5 e PTCH1. Ademais, as principais alterações cromossómicas detetadas por aCGH foram perdas em 4p, 5q, 6q, 8p, 15q e Xp e ganhos em 3q, 7p, 7q e 14q.No tecido não tumoral foram detetadas principalmente perdas no gene VHL.O WT1 foi o gene que surgiu metilado num maior número de doentes no tecido tumoral e não tumoral.Por outro lado, as principais CNVs detetadas por MS-MLPA no tecido tumoral dos doentes com gliomas foram perdas nos genes CREM e PYCARD e ganhos no gene CDK6. Dos genes analisados, o WT1 foi o único que surgiu metilado. Além disso, as principais alterações cromossómicas detetadas por aCGH foram perdas em 10p, 14q, 16p, 17p, 17q e 19p.A quantificação do cfDNA plasmático em doentes com cancro oral e gliomas é possível, mas mais estudos serão necessários para avaliar o seu potencial de translação para a prática clínica. Além disso, foram identificadas alterações em alguns genes e cromossomas que parecem ter potencial como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico. Mais estudos em coortes maiores serão necessários para validar estes resultados e estabelecer correlações genótipo-fenótipo.Liquid biopsies consist of the analysis of tumor-derived material, namely circulating tumor DNA (ctDNA), obtained in a minimally invasive manner from blood or other biofluids. In cancer patients ctDNA can be used for tumor molecular profiling. Variations in its concentration can be an indicator of tumor burden, cancer stage and response to therapy. Thereby, the first goal of this project was to correlate the dynamic changes of plasma cell-free DNA (cfDNA) levels in patients diagnosed with cancer, namely gliomas and oral cancer, before and during treatments, with their clinical features.Moreover, cancer is characterized by (epi)genomic instability. Understanding the molecular alterations underlying cancer development and progression could improve patient’s diagnosis, prognosis and treatment. Consequently, it was also aimed to identify genes that are most frequently altered in these patients, through the genomic and epigenetic characterization of tumor tissue before any treatment, and that could be useful as diagnostic and prognostic biomarkers.Considering the aims of this project, a total of 33 tumor tissue and macroscopically tumor-free samples and 81 biofluids (blood) samples were collected from 21 patients diagnosed with oral cancer and gliomas. The first collection was done before treatment in both tumor tissue and plasma (blood) samples. During treatment, blood was also collected in specific clinical timepoints. Total cfDNA isolated from plasma was quantified. The genomic and epigenetic characterization of tumor tissue were performed through array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) and Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MS-MLPA) techniques, respectively.Regarding the quantitative analysis of cfDNA, cancer patients had, on average, higher preoperative cfDNA plasma concentrations than the control group. In oral cancer patients, after the first treatment there was an increase in cfDNA levels which subsequently tended to decrease.The main copy number variations (CNVs) detected through MS-MLPA in the tumor tissue from oral cancer patients were losses of CDKN2A, VHL and STK11 and gains of MLH3, PAX5 and PTCH1. Additionally, the main alterations detected through aCGH were losses at 4p, 5q, 6q, 8p, 15q and Xp and gains at 3q, 7p, 7q, and 14q.In non-tumor tissue samples were mainly detected losses of VHL.WT1 is the most frequently methylated gene in both tumor and non-tumor tissue.On the other hand, the main CNVs detected through MS-MLPA in tumor tissue samples from gliomas patients were losses of CREM and PYCARD and gains of CDK6. WT1 is the only gene that appears methylated from those analysed. Furthermore, the main alterations detected through aCGH were losses at 10p, 14q, 16p, 17p, 17q and 19p.Quantification of plasma cfDNA in oral cancer and gliomas patients is possible, but further studies will be necessary to assess its translational potential into clinical practice. Also, alterations in some genes and chromosomes that seem to have potential as putative diagnostic and prognostic biomarkers have been identified. Further studies in larger cohorts will be required to validate these results and to do genotype-phenotype correlations