FUNÇÃO LISOSSOMAL NO PROCESSO DE INFEÇÃO POR CANDIDA: CX43, UM NOVO ELEMENTO NESTA INFEÇÃO

Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaInvasive Candidiasis (IC), a life-threatening fungal infection, can be caused by several Candida spp., being Candida albicans the most prevalent specie worldwide. C. albicans is a constituent of the microbiome in most healthy individuals. However, upon perturbations of host immunity, this fungus transits to an opportunistic pathogen. Macrophages are part of the first line of defense against infections as they can engulf and eliminate C. albicans through phagocytosis. After C. albicans engulfment, the yeast transits to a hyphal form inducing phagosomal membrane damage. In order to survive, macrophages require an efficient cellular response to rapidly counteract the hypha-induced cellular damage. Recently, the maintenance of the phagosomal membrane integrity was positively related with C. albicans length growth and escape. Furthermore, a new defense mechanism involving actin-contractile rings structures was elegantly described during C. albicans infection. Thus, considering these emerging studies and the lack of knowledge on the underlying molecular mechanisms involved in hypha-containing phagolysosomal membrane repair, we aimed to investigate the crucial mechanisms responsible to maintain phagolysosomal membrane integrity in macrophages infected with C. albicans by using a RAW 264.7 macrophage cell line. Our results suggested a potential activation of the repair machinery, through the recruitment of Alix and Tsg101, both components of the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) machinery, to C. albicans containing-phagosomes. In addition, we also observed a recruitment of Trim16, a lysophagy component, to the C. albicans-containing phagosome. Moreover, our results indicated that lysosomal biogenesis and autophagy were not the main defence mechanisms involved in macrophages response to C. albicans infection. Notably, we demonstrated that macrophage folding capacity decreased with loss of phagosomal membrane integrity and inhibition of autophagy. Lastly, to unveil new putative players involved in macrophages response to expanding hypha, we also performed an analysis of published transcriptomic data from C. albicans infected macrophages. Our findings highlighted Cx43 as a potential hit during C. albicans infection. Indeed, we found that Cx43 is recruited to phagosomes containing C. albicans and potentiate the folding capacity of macrophages. We also observed a high colocalization of Cx43 with the actin ring structures surrounding the C. albicans-containing phagosome. Taken together, our data unveiled new insights on the impact of the phagosomal membrane integrity, autophagy and lysosomal biogenesis, as well as a new possible non-canonical role of Cx43 on the macrophage immune response to C. albicans infection.Candidíase Invasiva (CI), uma infeção fúngica grave, pode ser causada por diversas espécies do género Candida, sendo Candida albicans a espécie mais predominante a nível mundial. C. albicans faz parte da flora da maior parte dos indivíduos saudáveis. Porém quando a imunidade do hospedeiro sofre perturbações, este fungo transita para um microrganismo oportunista. Os macrófagos fazem parte da primeira linha de defesa, tendo estas células a capacidade de internalizar e eliminar C. albicans, através da fagocitose. Após a internalização da C. albicans, o fungo sofre alterações na sua morfogénese, transitando para a forma de hifa, induzindo dano na membrana do fagossoma. Para garantir a sua sobrevivência, os macrófagos necessitam de uma resposta celular eficiente para combater rapidamente os danos celulares provocados pela hifa. Recentemente, a manutenção da integridade da membrana do fagossoma foi positivamente relacionada com o crescimento do tamanho da C. albicans e com a sua fuga. Foi também descrito um novo mecanismo de defesa envolvendo estruturas contráteis de actina em forma de anel, durante a infeção por C. albicans. Considerando estes estudos recentes, assim como a falta de conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos na reparação da membrana do fagossoma contendo a hifa, o nosso estudo teve como objetivo investigar os principais mecanismos responsáveis pela manutenção da integridade da membrana do fagossoma, utilizando uma linha de macrófagos RAW 264.7 infetados com C. albicans. Os nossos resultados sugeriram uma possível ativação da maquinaria de reparação, através do recrutamento da Alix e da Tsg101, ambas componentes da maquinaria de reparação endosomal sorting complex required for transport (ESCRT), para os fagossomas contendo C. albicans. Adicionalmente, observámos também o recrutamento de Trim16, um componente da maquinaria envolvida na lisofagia, para fagossomas contendo C. albicans. Os nossos resultados também indicaram que os mecanismos de biogénese lisossomal e de autofagia não fazem parte dos principais mecanismos de defesa envolvidos na resposta do macrófago à infeção por C. albicans. Adicionalmente demonstrámos que a capacidade do macrófago de dobrar hifas diminui com a perda da integridade da membrana do fagossoma e com a inibição da autofagia. Por último, para revelar novos intervenientes na resposta do macrófago à hifa em crescimento, realizámos também uma análise de dados publicados de transcriptómica de macrófagos infetados com C. albicans. Os nossos resultados demonstraram a conexina43 (Cx43) como um potencial hit durante a infeção por C. albicans. Efetivamente, foi observado um aumento do recrutamento da Cx43 para o fagossoma contendo C. albicans, assim como um aumento da capacidade dos macrófagos de dobrar as hifas. Encontrámos também uma grande colocalização de Cx43 com as estruturas de actina que se encontravam ao redor do fagossoma contendo C. albicans. Em suma, o nosso trabalho revela novos dados sobre o impacto da integridade da membrana do fagossoma, da autofagia e da biogénese lisossomal, assim como um potencial papel novo não canónico da Cx43 na resposta imune do macrófago à infeção por C. albicans.Outro - This work was financed by the European Regional Development Fund (ERDF), through the Operational Program for Competitiveness Factors (COMPETE; under the projects PAC “NETDIAMOND” POCI-01-0145-FEDER-016385; HealthyAging2020 CENTRO-01- 0145-FEDER-000012-N2323; POCI-01-0145-FEDER-007440, CENTRO-01-0145- FEDER-032179, CENTRO-01-0145-FEDER-032414, POCI-01-0145-FEDER-022122; FCTUID/NEU/04539/2013, UID/NEU/04539/2019, UIDP/04539/2020; and FCT/PT2020-02/SAICT/2017_424 Repai