Activation of a3 adenosine receptor using intraocular biodegradable implants as a strategy for the treatment of glaucoma

Tese de Doutoramento no âmbito do Programa Interuniversitário de Doutoramento em Envelhecimento e Doenças Crónicas apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.Glaucoma is a leading cause of irreversible blindness that is characterized by optic nerve damage and retinal ganglion cell (RGC) death. Elevated intraocular pressure (IOP) is an important risk factor in glaucoma and the only that is modifable. Indeed, current treatments are directed towards IOP lowering, however many patients continue to lose vision despite successful IOP control. Therefore, new and more effective treatments are necessary, and targeting neuroprotection of RGCs is considered to be an additional therapy. RGCs express adenosine A3 receptor (A3R) and its activation confers protection to RGCs following an excitotoxic stimulus, as occurs in glaucoma. These fndings strongly support that A3R activation can protect RGCs from glaucomatous damage. Therefore, we aimed to study the protective properties of A3R agonist against glaucomatous insult (Chapter 2). Ocular hypertension (OHT) was induced by laser photocoagulation of the limbal veins and A3R agonist (2-Cl-IB-MECA, 5 µl, 1.2 µM) was delivered intravitreally immediately after the induction of OHT. The outcome was assessed 7 days post injection. The treatment with A3R agonist increased RGC survival and attenuated the impairment in retrograde axonal transport induced by OHT, which is consistent with the preservation of the optic nerve structure. These benefcial effects of A3R activation may be contributing to the maintenance of the RGC function in OHT animals. Therefore, A3R can be suggested as a good therapeutic target to protect RGCs from glaucomatous damage. Drug delivery into the posterior part of the eye is mainly achieved by intravitreal injection. However, frequent intravitreal injections can lead to retinal detachment, cataract, and endophthalmitis. Therefore, the design of sustained drug delivery systems for the posterior segment of the eye can encompass a therapeutic breakthrough. The development of these systems has been a challenge for many years, but it is nowadays used in clinical practice for some retinal diseases. Biodegradable implants present an additional advantage since they are degraded into nontoxic products and, then safely eliminated, contrary to nonbiodegradable implants. Aiming to overcome the need of multiple intravitreal injections, herein a new biodegradable intraocular implant (porous poly(Ɛ-caprolactone) (PCL)-based intraocular implants) was developed for controlled drug release in collaboration with the Chemical Engineering Department of the Faculty of Sciences and Technology of the University of Coimbra (Chapter 3, supplementary information). Thus, the potential of PCL-based implants to be used as intraocular drug delivery device was assessed (Chapter 3). The presence of the PCL implant or the degradation products did not cause neuronal cell death, particularly did not affect the number of RGCs, in retinal primary neural cell cultures and retinal organotypic cultures, reinforcing the possibility of testing these implants in animal models. The PCL-based implants were surgically introduced in the vitreous of Wistar rats, and the outcome was evaluated at 4 and 8 weeks after the surgery. The presence of the PCL implant or the procedure did not change retinal function (evaluated by electroretinography, ERG) nor retinal structure (evaluated by optical coherence tomography, OCT). Moreover, PCL implant did not induce alterations in retinal neurons and had no toxic effect in RGCs in vivo, since the number of RGCs was not altered. The impact to retinal glial cells was assessed, and both the procedure and the presence of PCL implant may induce Müller cell gliosis, without affecting microglial cells and astrocytes. The assessment of retinal structure18 and Müller cell reactivity 1 year after surgery demonstrated that the structure was not altered and that Müller cell gliosis observed in early time points was a transient effect. Taking into consideration the lack of retinal toxicity of PCL implants, this new device can now be loaded with drugs to tackle retinal diseases. Indeed, since the activation of A3R confers protection to the retina, in particular to RGCs, implants loaded with 2-Cl-IB-MECA can be hypothesized as a new strategy to protect the retina from degeneration (Chapter 4). 2-Cl-IB-MECA-loaded PCL implants were developed in collaboration with the Chemical Engineering Department of the Faculty of Sciences and Technology of the University of Coimbra (Chapter 4, supplementary information). The PCL implant loaded with 2-Cl-IB-MECA presented an extended drug release of around 30 days. Then, the drug released from the implant maintained functional activity, as determined in vitro by single-cell Ca2+ imaging of RGCs. 2-Cl-IB-MECA-loaded PCL implants were immersed in a saline solution for 24 h that was able to reduce the glutamateevoked increase in intracellular Ca2+ concentration in immunopurifed RGC cultures. Drug-free and 2-Cl-IB-MECA-loaded PCL implants were introduced in the vitreous after inducing transient retinal ischemia, and the outcome was assessed 1 month after lesion induction. The presence of 2-Cl-IB-MECA-loaded PCL implants in the vitreous preserved the structure of the optic nerve and preserved the anterograde axonal transport. Moreover, the survival of RGCs was increased and the function of RGCs was maintained upon transient retinal ischemia, indicating that RGCs are protected from ischemia-reperfusion damage. These results suggest that A3R represents a potential drug target for the development of novel therapeutic strategies for glaucoma. Moreover, the incorporation of 2-Cl-IB-MECA in a biodegradable intraocular implant may be a promising therapeutic strategy for glaucoma.O glaucoma é umas das principais causas de cegueira, sendo caracterizado por danos no nervo ótico e morte das células ganglionares da retina (CGR). A pressão intraocular elevada (PIO) é um fator de risco e é o único que é modifcável. Os tratamentos atualmente usados na clínica são direcionados para o controlo da PIO, contudo muitos pacientes continuam a perder visão, apesar do controlo da PIO. Assim, torna-se necessário desenvolver novas abordagens terapêuticas e a proteção das CGR é considerada uma abordagem com potencial. As CGR expressam o recetor A 3 de adenosina (A3R) e a sua ativação confere proteção às CGR após estímulos excitotóxicos. Assim, o objetivo principal foi estudar os efeitos protetores do agonista do A3R contra o dano glaucomatoso (Capítulo 2). Utilizou-se um modelo animal de glaucoma induzindo hipertensão ocular por fotocoagulação das veias do limbo e o agonista do A3R (2-Cl-IB-MECA, 5 µl, 1.2 µM) foi administrado por injeção intravítrea imediatamente após a indução de hipertensão ocular. Os resultados foram analisados 7 dias após a injeção intravítrea. O tratamento com o agonista do A 3R aumentou a sobrevivência das CGR e atenuou o défce no transporte axonal retrógrado induzido pela hipertensão ocular. Estes resultados são consistentes com a preservação da estrutura do nervo ótico. Os efeitos benéfcos observados pela ativação do A3R poderão estar a contribuir para a manutenção da função das CGR nos animais com hipertensão ocular. Desta forma, podemos considerar o A3R um bom alvo terapêutico para conferir proteção às CGR contra o dano glaucomatoso. A entrega de fármacos para a parte posterior do olho é maioritariamente conseguida através de injeções intravítreas. Contudo, repetidas injeções podem levar ao descolamento da retina ou ao desenvolvimento de catarata. Assim, apesar do desenvolvimento de sistemas de libertação de fármacos para a parte posterior do olho ser um desafo, é já uma prática clínica para algumas doenças da retina. Os implantes biodegradáveis apresentam a vantagem de serem degradados em produtos não tóxicos e facilmente eliminados, ao contrário dos implantes não biodegradáveis. Com o objetivo de ultrapassar a necessidade de múltiplas injeções intravítreas foi desenvolvido um novo implante intraocular (à base de poli(Ɛ-caprolactona)) para libertação controlada de fármacos. Este implante foi desenvolvido em colaboração com o Departamento de Engenharia Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra (Capítulo 3, informação suplementar). Assim, o potencial deste implante de PCL ser usado como sistema de libertação intraocular de fármaco foi avaliado (Capítulo 3). A presença do implante de PCL, assim como os produtos de degradação, não causaram morte neuronal, e, em particular, não afetaram o número de CGR, em culturas primárias neuronais de retina e em culturas organotípicas de retina, reforçando a possibilidade de avaliar a segurança do uso destes implantes em modelos animais. Os implantes de PCL foram cirurgicamente introduzidos no vítreo de ratos Wistar e os resultados foram analisados 4 e 8 semanas após a cirurgia. A presença do implante de PCL, assim como o procedimento, não alteraram nem a função da retina (avaliado por electroretinografa, ERG) nem a estrutura da retina (avaliado por tomografa de coerência ótica, OCT). Além disso, os implantes de PCL não induziram alterações nos neurónios da retina e não alteraram o número de CGR. O impacto para as células da glia da retina foi também avaliado e, tanto o procedimento como a presença do implante induziram reatividade das células de Müller, sem20 afetar as células da microglia e os astrócitos. A avaliação da estrutura da retina e da reatividade das células da retina, após 1 ano após a cirurgia, mostrou que a estrutura se mantém inalterada e que a gliose das células de Müller observada nos tempos de experiência iniciais foi uma reação transitória. Sabendo que os implantes de PCL não induzem toxicidade para a retina, os implantes intraoculares de PCL podem ser carregados com um fármaco de forma a conferir proteção às CGR. Uma vez que a ativação do A3R confere proteção para a retina, e, em particular para as CGR, os implantes de PCL carregados com 2-Cl-IB-MECA podem ser formulados como uma nova estratégia terapêutica para a proteção da retina (Capítulo 4). Os implantes carregados com 2-Cl-IB-MECA foram desenvolvidos em colaboração com o Departamento de Engenharia Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra (Capítulo 4, informação suplementar). O implante de PCL carregado com 2-ClIB-MECA apresentou uma libertação prolongada de fármaco durante 30 dias. Além disso, o fármaco libertado a partir do implante manteve a sua atividade funcional para o recetor, tal como foi determinado por imagiologia de cálcio. Os implantes carregados com 2-Cl-IB-MECA foram submersos em solução salina durante 24 h o que reduziu o aumento da concentração de cálcio intracelular induzido por glutamato, em culturas purifcadas de CGR. Implantes carregados com 2-Cl-IB-MECA, assim como implantes sem fármaco, foram introduzidos no vítreo após a indução de isquémia da retina e, os resultados foram avaliados 1 mês depois. Os implantes carregados com 2-Cl-IB-MECA preservaram a estrutura do nervo ótico e aumentaram o transporte axonal anterógrado. Além disso, aumentou a sobrevivência das CGR, assim com preservou a sua função após isquémia transitória, o que indica que as CGR estão protegidas do dano causado pela isquémia-reperfusão. Estes resultados sugerem que o A3R representa um alvo para o desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica para o glaucoma. Além disso, a incorporação de 2-Cl-IB-MECA nos implantes intraoculares biodegradáveis pode ser uma estratégia terapêutica promissora