Classification and identification of thermophilic organisms isolated from São Pedro do Sul hot spring and revision of the classification of genus Meiothermus: integration of genomics into prokaryotic taxonomy

Tese de Doutoramento em Biociências, no ramo de especialização em Microbiologia, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.A vida em ambientes extremos tem sido intensamente estudada ao longo dos anos, com especial atenção para a diversidade dos microrganismos e para os mecanismos moleculares envolvidos na sua adaptação a esses ambientes. Organismos que prosperam sob condições ambientais extremas são designados de extremófilos. Organismos que apresentam crescimento ótimo a temperaturas elevadas são designados termófilos. Estes organismos podem ser encontrados em ambientes geotérmicos continentais, hidrotérmicos marinhos e em ambientes quentes artificiais. As estratégias de adaptação utilizadas por estes microrganismos devem-se muitas vezes à produção de biomoléculas específicas que têm vindo a ser estudadas e aplicadas em diversas áreas da biotecnologia ambiental, industrial e farmacêutica. Em Portugal, continental e ilhas, podem ser encontradas várias fontes termais com uma vasta diversidade em microrganismos termófilos. O objetivo deste trabalho de investigação foi expandir os conhecimentos sobre a microbiologia destes ambientes termofílicos, nomeadamente na nascente termal de São Pedro do Sul, localizada no centro de Portugal. A água termal emerge à superfície terrestre a uma temperatura de cerca de 68,0ºC. Tendo em conta os avanços tecnológicos da biologia molecular, especialmente relacionados com a genómica, esta tese aborda a taxonomia de novos isolados da fonte termal de S. Pedro do Sul e a revisão da classificação do género Meiothermus, com a integração da sequenciação de genomas e ferramentas de genómica comparativa na abordagem polifásica para descrição e classificação de microrganismos. Um recente organismo, foi isolado de uma amostra de biofilme da fonte termal em S. Pedro do Sul. Este microrganismo que forma colónias pigmentadas de laranja está relacionado com as espécies do género Thermonema da família Thermonemataceae, e representa o primeiro membro cultivado de uma nova linhagem distinta da ordem Cytophagales do filo Bateroidetes. O isolado SPSPC-11T possui características genotípicas e fenotípicas que se assemelham às das espécies do género Thermonema, mas apresentam diferenças notáveis em diversas características. Análises da sequência do genoma corroboraram muitas das características fenotípicas da estirpe SPSPC-11T, como a incapacidade de assimilar açúcares. Com base na caracterização fisiológica, bioquímica, quimiotaxonómica, genómica e filogenética foi possível descrever uma nova espécie de um novo género representada pela estirpe SPSPC-11T para a qual foi proposto o nome Raineya orbicola. A família Raineyaceae também foi descrita para acomodar este novo género e espécie. Representantes do filo Proteobacteria foram também isolados de uma amostra de água de S. Pedro do Sul, comprovando a diversidade microbiana destes ambientes termofílicos. A análise filogenética de duas estirpes, SPSP-6T e SPSPC-18, que formam colónias não pigmentadas e demonstraram ter 100% de similaridade na sequência do gene 16S rRNA, posicionou estes isolados num dos dois grupos formados pelo género Tepidimonas. Uma vez que apenas um pequeno número de características fenotípicas e quimiotaxonómicas permitem a distinção das espécies do género Tepidimonas, realizou-se uma análise comparativa dos genomas das estirpes tipo do género Tepidimonas, do novo isolado SPSP-6T e de estirpes filogeneticamente relacionadas para avaliar a taxonomia destes organismos. Os valores do índice global de relacionamento genómico corroboraram os resultados da análise filogenética baseada na sequência do gene 16S rRNA e de 400 sequências de genes conservados, confirmando as linhagens distintas das oito espécies. Considerando a análise fenotípica, quimiotaxonómica, genómica e filogenética, todas as estirpes foram circunscritas ao género Tepidimonas. A estirpe SPSP-6T foi descrita como uma nova espécie do género Tepidimonas e denominada Tepidimonas charontis. Um grupo de bactérias frequentemente encontrado em fontes termais com características como as de S. Pedro do Sul inclui bactérias do género Meiothermus, que pertence à família Thermaceae, e representa uma linhagem distinta dentro do filo Deinococcus-Thermus. Estirpes do género Meiothermus foram isoladas de várias áreas geotérmicas por todo o mundo. A estirpe tipo da espécie M. timidus SPS-243T foi isolada da fonte termal de S. Pedro do Sul. Das treze espécies do género Meiothermus, nove formam colónias pigmentadas de vermelho e quatro formam colónias pigmentadas de amarelo. As relações filogenéticas intragenéricas das treze espécies do género Meiothermus foram avaliadas por filogenómica. Os resultados indicaram que estas espécies formam pelo menos três linhagens distintas principais que podem ser consideradas como representativas de géneros distintos. A heterogeneidade do género foi sustentada pelos parâmetros do índice global de relacionamento genómico. Com base nos resultados da análise filogenética e genómica, e nas características quimiotaxonómicas e fenotípicas, o género Meiothermus foi circunscrito a oito espécies, o que levou a emendar a descrição do género Meiothermus e à reclassificação das quatro espécies que formam colónias pigmentadas de amarelo M. chliarophilus, M. roseus, M. terrae e M. timidus como membros de um novo género chamado Calidithermus, no entanto não foi possível clarificar a classificação de M. silvanus. Vários grupos taxonómicos dos domínios Bacteria e Archaea foram sujeitos a reclassificações a partir do momento que a informação do genoma começou a ser utilizada mais frequentemente pelos taxonomistas. Estudos taxonómicos recentes comprovam que a incorporação da genómica na taxonomia dos procariontes permite alcançar conclusões mais robustas sobre a caracterização de microrganismos, constituindo um passo importante para o aperfeiçoamento da classificação dos procariontes.Life in extreme environments has been studied intensively over the years, focusing on the diversity of organisms and the molecular mechanisms involved in their adaptation in these environments. Organisms that thrive under extreme environmental conditions are referred to as extremophiles. Organisms that grow optimally at high temperatures are designated thermophiles and are found in continental geothermal, marine hydrothermal and man-made hot environments. The search for the existence of microorganisms in these environments has brought great insight into microbial diversity and the adaptation mechanisms that allow thermophiles to live and grow in these extreme conditions. Their adaptation strategies are often due to the production of specific biomolecules that have been studied for years as sources for environmental, industrial, and pharmaceutical biotechnological applications. However, much remains to be known about the microbial diversity of these extreme environments. In Portugal, in the mainland and islands, there are several hot springs with great diversity in thermophilic microorganisms. This research work aimed to extend the current knowledge on the microbiology of these thermophilic environments, specifically on the hot spring of São Pedro do Sul, located in central Portugal. This thermal water has a temperature of about 68.0ºC. Benefiting from the technological advances in molecular biology, especially those related to genomics, this thesis addresses the taxonomic study of new isolates from S. Pedro do Sul hot spring and the revision of the classification of the genus Meiothermus, integrating genome sequencing and comparative genomics tools into the polyphasic approach for microorganism description and classification. The new strain SPSPC-11T was isolated from a biofilm sample from the S. Pedro do Sul hot spring. This orange-pigmented colony forming microorganism was most closely related to the species of the genus Thermonema of the family Thermonemataceae and represents the first cultured member of a new distinct lineage of the order Cytophagales of the phylum Bateroidetes. The isolate SPSPC-11T possesses genotypic and phenotypic features that resemble those of the species of the genus Thermonema, but there are notable differences in several characteristics. The high-quality draft genome sequence analyses corroborated many of the phenotypic characteristics of the strain SPSPC-11T, such as the inability to assimilate sugars. Based on physiological, biochemical, chemotaxonomic, genomic and phylogenetic characterization, a new species of a novel genus was described, represented by strain SPSPC-11T for which the name Raineya orbicola was proposed. The family Raineyaceae was also described to accommodate this new genus and species. Representatives of the phylum Proteobacteria were also isolated from a water sample of S. Pedro do Sul hot spring, supporting the diversity of microbes that inhabits thermophilic environments. The phylogenetic analysis of two non-pigmented strains, SPSP-6T and SPSPC-18, that share 100% pairwise similarity of the 16S rRNA gene sequence, located these isolates within one of the two clusters formed by the genus Tepidimonas. Only a small number of phenotypic and chemotaxonomic characteristics distinguish the species of Tepidimonas, which led to a comparative analysis of the genome sequences of the eight type strains of the genus Tepidimonas, the new isolate SPSP-6T and three closely related strains to assess the taxonomic position of the organisms. The values of the overall genome relatedness index corroborated the results of the phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence and 400 conserved genes sequences, regarding the distinct lineages of the eight species. Considering the phenotypic, chemotaxonomic, genomic, and phylogenetic analysis, all strains were circumscribed to the genus Tepidimonas. Strain SPSP-6T was described as a new species of the genus Tepidimonas and named Tepidimonas charontis. A group of bacteria most commonly found in hot springs with characteristics such as those of S. Pedro do Sul is the genus Meiothermus, which belong to the family Thermaceae, and represents a distinct lineage within the phylum Deinococcus-Thermus. Strains of the genus Meiothermus have been isolated from several geothermal areas around the world. The type strain M. timidus SPS-243T was isolated from S. Pedro do Sul hot spring. Of the thirteen species of genus Meiothermus nine species form red-pigmented colonies and four species form yellow-pigmented colonies. The intrageneric phylogenetic relationships of the thirteen type strains of the genus Meiothermus were assessed by phylogenomics. Results indicated that species of the genus Meiothermus form at least three major distinct lineages that may be considered to represent distinct genera. The overall genome relatedness index parameters supported the heterogeneous nature of the genus. Based on the results of the phylogenetic and genomic analysis, chemotaxonomic and phenotypic characteristics, the genus Meiothermus was circumscribed to eight species, which led to emend the description of the genus Meiothermus and the reclassification of the four yellow-pigmented species M. chliarophilus, M. roseus, M. terrae and M. timidus as members of a novel genus named Calidithermus, however the classification of M. silvanus could not be clarified. Several taxonomic taxa of Bacteria and Archaea underwent revisions and reclassifications when the genomic data start to be more commonly used by taxonomists. Recent taxonomic studies support that the approach of incorporating genomics into prokaryotic taxonomy provides more robust conclusions about the characterization of microorganisms, constituting an important step towards improving classification of prokaryotes