O Papel do Córtex Cingulado em Memória de Trabalho

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia(FULL VERSION IN THESIS) In our daily lives, we are confronted with the need to acquire new information, maintain it in memory for a short period, retrieve it when need it, and forget it once no longer needed. The neural mechanisms underlying this form of memory, named working memory (WM) remain unknown, but are hypothesized to depend on complex, fined tuned interactions between different brain regions, namely, the hippocampus (HIPP) and anterior cingulate cortex (CG). A classical paradigm to study WM in rodent is the delayed non-matching to sample (DNMS), where animals are rewarded for performing one “sample” action (a trajectory on a maze), wait for a variable time lapse (15-30 seconds), and are then presented with two possible “test” options (two trajectories), being rewarded for choosing the non-sampled course. Such behavior depends on WM, as it involves the encoding of new information (sampled trajectory), its maintenance for a short period (15-30 seconds), and its retrieval when needed (test trajectory). Long-range cortical connections between the HIPP and CG have the potential of providing the CG with a permanent source of contextual information, both structures exhibiting dynamic synchronization during spatial paradigms that require WM. If this is true, then performance in WM paradigms such as the DNMS should be affected by disturbances of CG, something presently debated, as experiments aiming to address this question yielded conflicting results. In the present work, we used a light-sensitive ion pump (eNpHR3.0) expressed in CG neurons to silence CG neural activity with spatiotemporal precision control, while adult Long Evan rats ran a trajectory (DNMS task).To our surprise, in animals expressing eNpHR3.0 in CG, but not the “empty” control construct, we consistently detected the presence of a scar-like formation in CG, independent of light-activation of the opsin or fiberoptic implant. Our preliminary data indicates that rats trained to maximal proficiency in the DNMS task (8-21 days/sessions per animal) and then tested for 15 daily sessions in the DNMS exhibit no significant deficits in global proficiency once eNpHR3.0-expressing CG is illuminated. Analysis of finer aspects of behavior led us to detect significant differences in error trials’ dynamics, with eNpHR3.0 expression in CG causing animals to take shorter times to reach the decision point, and spending less time at that point before committing themselves with a decision. Since: a) the scar-like formation in these animals might constitute a “lesion” with functional consequences, b) we do not know whether neural activity in the region was affected by it, as we have no electrophysiological or other evidence of neural activity simultaneous with optogenetics and, c) there is a known role for CG in error-detection and in processing mnemonic/contextual information in the service of decisional behavior, our preliminary data is consistent with the following scenario:1- CG integrity is not absolutely necessary for DNMS performance in well-trained rats.2- Lesions in CG shorten the duration of the decisional process, perhaps triggering a faster, successful compensatory process that bypasses CG.3- Light-delivery during the test phase of the DNMS task decreases performance, regardless of the presence of eNphHR3.0, possibly constituting a problematic distractor.Such observations warrant the continuation of experiments aiming to determine the role of CG in distinct aspects of memory-related decisional behavior, and of monitoring HIPP-CG activity during optogenetic manipulations of this circuit.Rats can navigate in space using multiple strategies, and reference their behavior to distinct cues, present in the environment, and retrieved from memory. Examples of such cues are the topographical structure of surrounding context, allocentric or word-centered cues, and body position and motion, egocentric or body-centered cues. To investigate which strategies adult male Long Evans rats use to solve the DNMS task, we developed a novel behavioral protocol, the non-match catch (NMC) protocol, using a plus maze whose one arm was blocked to resemble the DNMS apparatus, allowing us to run the DNMS, followed by a catch trial in which the animal is released from the previously blocked arm (“novel”). Assuming the non-matching rule is preserved, choices in the catch trial corresponding to either a non-match to body turn or to position, allow us to quantify which strategies are used more often. Our results agree with preliminary studies in other tasks, and suggest that animals use both allocentric and egocentric strategies, with no preference for one over the other. Since egocentric and allocentric strategies engage different brain circuits, the NMC protocol can be a promising method to infer which strategies were employed at any moment and, in combination with neural recording and manipulation, to inquire which neural circuits underlie distinct behavioral strategies.(VERSÃO COMPLETA NA TESE) O nosso dia-a-dia está repleto de momentos onde necessitamos de adquirir novas informações, retê-las na nossa memória durante um curto período de tempo, recuperá-las quando precisamos e, por último, esquecê-las quando já não nos são úteis. Os mecanismos neuronais que sustentam este tipo de memória, denominada de memória de trabalho (MT), não são conhecidos, porém, sabe-se que dependem de interações entre diferentes regiões cerebrais, nomeadamente, entre o hipocampo e o córtex cingulado (CG). A MT é geralmente estudada em ratos utilizando a tarefa DNMS (delayed non-matching to sample), realizada num labirinto em forma “T”. Primeiro, os ratos são recompensados por realizarem uma das duas trajetórias do labirinto. De seguida, esperam 15-30 segundos, e, posteriormente, escolhem entre as duas trajetórias possíveis do labirinto. No entanto, só são recompensados se escolherem a trajetória oposta à anteriormente realizada. Esta tarefa depende de MT, porque envolve a codificação da nova informação (trajetória realizada), a retenção desta durante um curto espaço de tempo (15-30 segundos) e, a sua recuperação (realização da trajetória oposta). Evidências sugerem que, durante a execução de tarefas dependentes de MT, a conectividade funcional existente entre neurónios do hipocampo e do CG e, o fato de ocorrer sincronização entre estas áreas cerebrais, suportam o fornecimento de informações contextuais sobre a tarefa ao CG. Assim sendo, espera-se que perturbações à normal atividade do CG afetem a performance em tarefas dependes de MT. No entanto, esta ideia é ainda debatida por existirem resultados conflituosos entre diferentes estudos que tem por objetivo responder a esta questão. Neste trabalho expressámos uma bomba de cloreto sensível à luz (eNpHR3.0) nos neurónios do CG de ratos Long Evans para controlar de forma precisa, no tempo e espaço, a atividade neuronal desta região enquanto os animais realizavam a DNMS.Inesperadamente foi detetada a presença de uma “cicatriz” no CG de todos os animais que expressaram eNpHR3.0 nesta região do córtex. Uma análise preliminar dos nossos dados indica que ratos com muita experiência na DNMS (8-21 sessões de treino e 15 sessões de teste) não apresentam défices na performance da mesma quando a eNpHR3.0, expressa nos neurónios do CG, é iluminada. No entanto, a expressão de eNpHR3.0 no CG dos animais, torna-os mais rápidos a chegar ao local da DNMP onde expressam uma escolha, permanecendo posteriormente mais tempo neste mesmo local. Visto que a “cicatriz” poderá ter constituído uma “lesão” permanente no CG com consequências funcionais, não podendo garantir que a atividade neuronal desta região foi afetada e tendo em conta o papel desempenhado pelo CG na monitorização de erros e no processamento de informações contextuais, os nossos dados são coerentes com as seguintes ideias:1. O envolvimento do CG não é estritamente necessário para realizar a DNMS em ratos com muita experiência na mesma; 2. Lesões no CG diminuem o tempo necessário à execução dos processos envolvidos em tomada de decisão, possivelmente por desencadear o desenvolvimento de mecanismos neuronais compensatórios mais rápidos, eficazes e independentes do CG; 3. A luz, utilizada para ativar a eNpHR3.0, durante a fase de teste da DNMS diminui a performance em ambos os grupos experimentais, sendo talvez um fator distrativo.Estes aspetos deverão ser tomados em consideração em estudos que investigam o papel do CG em diferentes aspetos dos comportamentos dependentes de MT, mas também, em estudos optogenéticos que envolvam a manipulação do circuito existente entre o hipocampo e o CG. Para navegar no espaço, os ratos podem optar por estratégias de navegação egocêntrica (centrada no corpo) e alocêntrica (centrada no espaço). Para investigar que estratégias os ratos Long Evans utilizam para resolver a DNMS, criámos um novo protocolo comportamental, “non-match catch (NMC) protocol”, que se assemelha à DNMS. Este protocolo é realizado num labirinto em forma de “+”, mas um dos seus braços está bloqueado, reproduzindo a forma “T” da DNMS. No final de cada sessão, os animais iniciam a corrida de teste no braço do labirinto até ao momento bloqueado. Assumindo que a regra “non-match” da DNMS é mantida, é possível distinguir entre as estratégias de navegação: se escolherem o braço visitado previamente estão a utilizar uma estratégia egocêntrica e, se optarem pelo braço contrário, estão a utilizar uma estratégia alocêntrica. Os nossos resultados sugerem que os animais utilizaram tanto estratégias alocêntricas como egocêntricas, sem preferência por uma em detrimento da outra. Visto que, cada uma das estratégias envolve circuitos cerebrais diferentes, este novo protocolo pode ser um método promissor para inferir que estratégias estão a ser utilizadas pelos animais, e, em combinação com estudos de lesão/manipulação, pode ser útil para compreender que circuitos neurais estão subjacentes a cada estratégia.FC