Radium-223 in treatment of metastatic prostate cancer

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaO cancro da próstata (CaP) é a segunda neoplasia masculina mais comum em todo o mundo, sendo que em 2020 foram diagnosticados 1 414 259 casos de CaP. A terapia de privação de androgénios é o tratamento de primeira linha para o CaP avançado, no entanto, a regressão do tumor após a castração é, frequentemente, apenas temporária e o tumor reincide e progride para a resistência à castração . Neste estádio do CaP, é muito comum o aparecimento de metástases, sendo que as metástases ósseas são as mais frequentes. Este tipo de metástases ocorre em mais de 90% dos doentes e provoca sintomas como fraturas, anemia e perda de peso, os quais levam à diminuição da qualidade de vida do doente. Este estado avançado da doença não tem cura, mas o rádio-223 revela-se uma opção terapêutica que melhora a sobrevivência global e diminui a dor associada a alguns efeitos secundários. Sabe-se que este radioisótopo, emissor predominante de partículas α, infiltra-se no tecido ósseo e vai ser incorporado pelos osteoblastos, contudo, os mecanismos subjacentes aos seus efeitos no nicho metastático ainda não estão completamente compreendidos. O objetivo principal deste projeto é, então, o estudo dos efeitos do rádio-223 em modelos celulares tridimensionais e homotípicos de CaP. Para o atingir, este trabalho iniciou-se com a otimização e caracterização de modelos celulares tridimensionais homotípicos de CaP. Seguiu-se a translação e validação do modelo de irradiação com rádio-223 para os modelos 3D para, por fim, permitir a avaliação dos efeitos radiobiológicos do rádio-223 nos modelos tridimensionais, utilizando diversas técnicas de biologia celular e molecular. Para tal, foram utilizadas duas linhas celulares de CaP (PC3 e LNCaP) e foi desenvolvido um modelo 3D de esferoides, recorrendo à junção dos métodos hanging drop e magnetic levitation. A validação do método de irradiação e de cálculo de dose do rádio-223 para os modelos 3D foi realizada através da avaliação dos efeitos biológicos em termos de conteúdo proteico e de atividade metabólica celular, após irradiação dos esferoides e utilizando duas abordagens experimentais diferentes para obter a mesma dose de irradiação. Após validação, os efeitos do rádio-223 nos esferoides foram estudados após irradiação com doses até 40 mGy, avaliando-se para a dose mais elevada os efeitos na proliferação, sobrevivência e viabilidade celulares.Através da metodologia desenvolvida, foi possível criar, de uma forma eficaz, esferoides de células PC3 reprodutíveis e compactos, capazes de manter a sua estrutura ao longo de 10 dias. Os esferoides constituídos por células LNCaP aumentaram a sua compactação ao longo dos dias, mas apresentaram forma e área muito distintas entre si, pelo que não foram utilizados para os estudos de radiobiologia. A equação do cálculo de dose do rádio-223 foi validada para a irradiação de modelos celulares 3D, não se verificando diferenças significativas entre os efeitos biológicos observados com as duas abordagens usadas. A avaliação da atividade metabólica celular, após irradiação dos esferoides com doses até 40 mGy, permitiu aferir indiretamente que o aumento da dose não levava a uma diminuição acentuada da proliferação. Contudo, através do ensaio com marcação por Ki-67, verificou-se uma diminuição da proliferação celular para uma dose de 40 mGy. Este efeito é confirmado pela progressiva desintegração do esferoide ao longo do tempo e pelo aumento de eventos como apoptose e necrose. O ensaio clonogénico mostrou, ainda, uma perda total da capacidade clonogénica das células quando sujeitas a uma dose de 40 mGy, indicando a perda de capacidade de sobrevivência a longo prazo após irradiação com rádio-223. Desta forma, os resultados obtidos confirmam que o rádio-223 provoca um efeito citotóxico, diminuindo o tamanho dos esferoides, a proliferação, a capacidade clonogénica e aumentando os eventos relacionados com morte celular. Estes efeitos foram verificados em modelos celulares 3D, estruturas moleculares mais complexas e mais próximas do microambiente tumoral, sustentando assim a sua utilização para futuros estudos do mecanismo molecular do rádio nas metástases do CaP. Este conhecimento permitirá aprofundar as potencialidades do rádio-223 e maximizar a sua aplicabilidade, tendo em vista o aumento da sobrevivência glocal e a melhoria da qualidade de vida do doente com CaP.Prostate cancer is the second most common neoplasm in the world in men, with 1 414 259 reported cases in 2020. The first-line treatment for advanced-stage prostate cancer is androgen deprivation therapy, but the tumor regression after castration is temporary in most cases, with a consequent and progressive castration-resistant relapsing. In this growth stage, the formation of metastases is very common, with bone metastases being the most frequent conditions, present in more than 90% of the patients. They cause other conditions like bone fractures, anemia, and weight loss, ultimately leading to a decrease in the patient’s quality of life. There is no cure for prostate cancer in this advanced-stage, but radium-223 presents a viable therapeutic option, both improving the overall survival rate and the pain associated with some side effects of the disease. This radioactive isotope emits predominantly α-particles, penetrating the bone tissue incorporated by the osteoblasts. However, the effects of these mechanisms in the metastatic environment are not fully understood.The main goal of this project is to study the effects of radium-223 in homotypic three-dimensional cellular models of prostate cancer. To assess such effects, the optimization and characterization of the homotypic three-dimensional cellular models were first performed. Then, the adaptation and validation of the irradiation model with radium-223 into the 3D models were done, allowing the evaluation using several cellular and molecular biological techniques of the radiobiological effects of the isotope in such models.To achieve this, two cell lines of prostate cancer (PC3 and LNCaP) were used, and a 3D spherical model was developed, adopting the hanging drop and magnetic levitation methods. The validation of the irradiation method and the calculation of the dose of radium-223 for the 3D models were performed by evaluating the biological effects in the protein content and cell metabolic activity, after irradiating the spheroids through two different experimental approaches, in order to obtain the same irradiation dose. After the validation, the effects of radium-223 in the spheroids were studied after irradiation with doses up to 40 mGy, evaluating, for the highest dose, the cellular effects on proliferation, survival and viability.Using this methodology, it was possible to effectively create reproducible and compact spheroids of PC3 cells, capable of maintaining their structure for 10 days. The spheroids of LNCaP increased their compactness through the days, but were not used in the radiobiological studies, as they manifested very distinct sizes and areas. The equation for the calculation of the dose for radium-223 was validated for the irradiation of the 3D cellular models, since no significant differences were observed between the two experimental approaches used. The evaluation of the cell metabolic activity, after irradiating the spheroids with doses up to 40 mGy, allowed to conclude that the increase of the radium-223 dose does not alter cell proliferation. However, it was observed a decrease in Ki-67 expression for a dose of 40 mGy. This effect is confirmed by the progressive disintegration of the spheroid overtime, and by the increase of events like apoptosis and necrosis. Moreover, the clonogenic assay showed a total loss of the clonogenic capacity of the cells irradiated with a 40 mGy dose, indicating a loss of the long-term survival capability after the radium-223 irradiation.In conclusion, the results confirmed that radium-223 has a cytotoxic effect on the spheroids, decreasing the size, proliferation, and clonogenic capacity of the spheroids, and increasing the effects related to cellular death. These effects were observed in 3D cellular models, which are complex molecular structures similar to the tumor microenvironment, therefore supporting future studies of the molecular mechanism of radium-223 against prostate cancer metastases. This knowledge will allow deepening the potentialities of radium-223 and maximizing its use with the goal of increase the global survival and enhance the quality of life of prostate cancer patients.FC