Estudo estrutural in silico do inibidor de proteases BTCI em complexo com a tripsina e quimotripsina e efeito anticarcinogênico deste inibidor nanoestruturado

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2020.O inibidor de tripsina e quimotripsina extraído de sementes do feijão-de-corda Vigna unguiculata (BTCI) é uma proteína com elevado potencial biotecnológico. Desde o combate às pragas de lavoura, como o bicudo-do-algodoeiro, até o controle da homeostase no sistema renal, o BTCI se mostra um promissor agente. Todavia, nos últimos anos tem sido explorada principalmente sua atividade anticarcinogênica. Estudos recentes demonstraram que este inibidor induz efeitos citotóxicos e citostáticos em células de adenocarcinoma mamário invasivo e não invasivo. O que realça ainda mais sua viabilidade nesse contexto é o fato de, concomitantemente a estas consequências para células neoplásticas, células sadias não serem afetadas. Com isso, o BTCI se mostra um agente com potencialidade ainda mais pronunciada ao não manifestar os efeitos adversos advindos de tratamentos quimioterápicos. Neste sentido, um dos objetivos do presente trabalho foi encapsular o BTCI em nanopartículas de quitosana a fim de maximizar sua conjugação com as células tumorais. Uma das possíveis rotas bioquímicas na qual o BTCI atua ao adentrar estas células é a da degradação proteica proteassômica mediante ubiquitinação. Ancorando-se ao proteassoma 20S, inativa-o, tornando inviáveis as células neoplásticas. A interação BTCIproteassoma se dá em sítios semelhantes aos da tripsina e quimotripsina. Entretanto, ainda não há uma descrição clara do mecanismo químico que ocorre quando dessa ligação, dado que, pelo grande tamanho do proteassoma, estudos experimentais e computacionais são por demais custosos. Sendo assim, objetivou-se também, por técnicas in sílico semi-empíricas utilizando as metodologias PM6-D3H4/COSMO e SCC-DFTB3-D3H4X/COSMO, aferir as principais interações que ocorrem quando da formação dos sistemas BTCItripsina e BTCI-quimotripsina, identificando os resíduos mais colaborativos destas três proteínas. Nos ensaios relativos à nanoestruturação do BTCI, observou-se que, contra células de MCF-7, as nanopartículas atenuavam os efeitos citotóxicos em comparação com aqueles relativos ao inibidor puro. Portanto, os resultados obtidos indicaram que, em estudos posteriores, o método de nanoestruturação deverá ser redesenhado. Por outro lado, os experimentos computacionais revelaram uma excepcional convergência em relação aos dados presentes na literatura. Em ambos os sistemas BTCI-tripsina e BTCI-quimotripsina, as rotinas computacionais foram capazes de identificar tanto os resíduos da tríade e do bolsão catalíticos quando os da cavidade oxiônica. Assim sendo, a rotina in sílico aqui adotada permitiu identificar os resíduos mais importantes para o mecanismo de inibição das proteases em questão pelo BTCI. Por fim, de modo igualmente eficaz, esta abordagem evidenciou a importância energética das moléculas de água para a ancoragem do BTCI à tripsina – fato também já previsto pela literatura. Portanto, os resultados deste trabalho mostraram que a metodologia semiempírica utilizada foi adequada para o estudo das interações químicas existentes no nos sistemas formados pelo BTCI e pelas serinoproteases tripsina e quimotripsina. A partir disso, ensaios posteriores poderão ser formulados para o entendimento do sistema BTCI-proteassoma - visto que os sítios reativos são semelhantes àqueles das proteases -, esclarecendo o mecanismo inibitório de células tumorais por parte do BTCI.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).The trypsin and chymotrypsin inhibitor extracted from the seeds of cowpea Vigna unguiculata (BTCI) is a protein with high biotechnological potential. It shows high activity against the boll weevil, a beetle that damage cotton cultivation. Besides that, it can regulate homeostasis in the kidney system. However, in recent years, its anticarcinogenic activity has been in the spotlight. Recent studies have shown that this inhibitor induces cytotoxic and cytostatic effects in invasive and non-invasive breast adenocarcinoma cells. Furthermore, healthy cells are not affected. As a result, BTCI proves to be even more relevant as it does not manifest the adverse effects arising from chemotherapy treatments. In this sense, one of the objectives of the present work was to encapsulate BTCI in chitosan nanoparticles in order to maximize its conjugation with tumor cells. One of the possible biochemical routes in which BTCI acts when entering these cells is the ubiquitin proteasome pathway. It inactivates the proteasome 20S by binding to it, making neoplastic cells inviable. The BTCIproteasome interaction occurs at trypsin and chymotrypsin-like sites. However, there is no clear description of the chemical mechanism involved in that reaction. Due to the large size of the proteasome, experimental and computational studies are too demanding. Thus, another objective of this work was, through computational techniques, using the semi-empirical PM6-D3H4 / COSMO and SCC-DFTB3-D3H4X / COSMO methodologies, seek the main interactions that occur by the biding of BTCI to trypsin and chymotrypsin, identifying the most collaborative residues of these three proteins. Regarding nanoencapsulation of BTCI, it was observed that, against MCF-7 cells, the nanoparticles attenuated the cytotoxic effects in comparison with those related to the inhibitor by itself. Thus, in this perspective, the results obtained indicated that, in subsequent studies, the nano structuring method should be redesigned. On the other hand, the computational experiments revealed an exceptional convergence in relation to experimental data. In both BTCI-trypsin and BTCI-chymotrypsin systems, was possible to identify the catalytic triad, the S1 site and the oxyanion hole. Therefore, it can be stated that the methodology adopted here was successful in identifying the most important residues for both proteases inhibition mechanisms. Finally, this approach was equally effective highlighting the energetic importance of water molecules for anchoring of BTCI to trypsin - a fact that is also experimentally proven. Therefore, this work shows the existence of an effective semi-empirical methodology to assign the most important residues to the BTCI-trypsin and BTCI-chymotrypsin systems. Thereafter, further studies can be formulated to understand the BTCI-proteasome system - since its reactive sites are similar to trypsin and chymotrypsin ones -, helping to clarify the mechanism in which BTCI inhibit tumor cells