Estructura y función del complejo PeBoW como modelo en el desarrollo de posibles herramientas terapéuticas

[ES] La biogénesis ribosomal es uno de los procesos más complejos, esenciales y costosos energéticamente de la célula eucariota. La formación de las subunidades ribosomales en levaduras comienza en el nucléolo con la transcripción del ARNr. En este proceso se requiere la participación de más de doscientos factores de ensamblaje y ARNs pequeños nucleolares (snoARNs) que no formarán parte del ribosoma maduro aunque son necesarios para un apropiado procesamiento del ARNr y organización estructural de las subunidades ribosomales. Los estudios estructurales de los estadios de maduración de la subunidad 60S han permitido la identificación de algunas interacciones funcionales entre los distintos factores de ensamblaje. Entre ellos se encuentran las proteínas Nop7, Erb1 e Ytm1 que forman un heterotrímero discreto denominado subcomplejo Nop7 en levaduras, o complejo PeBoW en mamíferos, compuesto por los ortólogos Pes1, Bop1 y WDR12, respectivamente. Este complejo puede detectarse de forma aislada de las partículas prerribosomales. La formación de este heterotrímero es esencial para el ensamblaje de la subunidad 60S ya que garantizan la correcta maduración del extremo 5' del ARNr 5,8S facilitando así su asociación con el ARNr 25S, aunque se desconoce en detalle el papel exacto en la biogénesis ribosomal. En este trabajo se ha realizado un análisis de las interacciones entre los componentes del PeBoW así como una aproximación a la resolución estructural del complejo en solución. Usando una combinación de técnicas biofísicas, nuestros resultados indican que la conformación estructural que adopta el complejo PeBoW en el nucleoplasma es diferente a la descrita en el contexto prerribosomal. Además, se han identificado posibles funciones que podría estar ejerciendo el complejo PeBoW o bien las distintas proteínas del complejo de forma aislada fuera del prerribosoma. Asimismo se conoce que la biogénesis ribosomal es un mecanismo altamente regulado y estrechamente relacionado con crecimiento y proliferación celular. La imperiosa necesidad de síntesis de ribosomas y proteínas que tiene una célula tumoral convierte a este proceso en un punto débil de la misma. Por esta razón, hay un gran interés para estudiar la biogénesis ribosomal como diana terapéutica contra el cáncer. Se ha observado que la paralización de esta vía es capaz de promover la activación no genotóxica del supresor tumoral p53, a diferencia de los efectos indeseados que provocan las terapias convencionales contra el cáncer. Como primer paso hacia el desarrollo de herramientas inhibidoras de la biogénesis del ribosoma, hemos utilizado la información cristalográfica que poseíamos del complejo de Chaetomium thermophilum entre los factores de ensamblaje Erb1 e Ytm1 para realizar una selección guiada por la estructura de péptidos de interferencia. Los péptidos de interferencia han sido analizados in vitro para determinar su capacidad de interacción utilizando técnicas biofísicas. Además, se han generado péptidos de interferencia con la secuencia humana de Erb1/Ytm1 para evaluar sus efectos en cultivo de células de cáncer de colon HCT-116. Nuestros resultados indican que el estrés ribosómico se puede inducir en diferentes etapas del proceso de maduración al dirigirse a las interacciones proteína-proteína, elevándolas como una alternativa al uso de inhibidores de la ARN pol I.[CA] La biogènesi ribosomal és un dels processos més complexos, essencials i costosos energèticament de la cèl·lula eucariota. La formació de les subunitats ribosomals en llevats comença en el nuclèol amb la transcripció de l'ARNr. En aquest procés es requereix la participació de més de dos-cents factors d'assemblatge i ARNs xicotets nucleolars (snoARNs) que no formaran part del ribosoma madur encara que són necessaris per a un apropiat processament de l'ARNr i organització estructural de les subunitats ribosomals. Els estudis estructurals dels estadis de maduració de la subunitat 60S han permès la identificació d'algunes interaccions funcionals entre els diferents factors d'assemblatge. Entre ells es troben les proteïnes Nop7, Erb1 i Ytm1 que formen un heterotrímer discret denominat subcomplex Nop7 en llevats, o complex PeBoW en mamífers, compost pels ortòlegs Pes1, Bop1 i WDR12, respectivament. Aquest complex pot detectar-se de forma aïllada de les partícules prerribosomals. La formació d'aquest heterotrímer és essencial per a l'assemblatge de la subunitat 60S ja que garanteix la correcta maduració de l'extrem 5' de l'ARNr 5,8S facilitant així la seua associació amb l'ARNr 25S, encara que es desconeix detalladament el paper exacte en la biogènesi ribosomal. En aquest treball s'ha realitzat una anàlisi de les interaccions entre els components del PeBoW així com una aproximació a la resolució estructural del complex en solució. Utilitzant una combinació de tècniques biofísiques, els nostres resultats indiquen que la conformació estructural que adopta el complex PeBoW en el nucleoplasma és diferent a la descrita en el context prerribosomal. A més, s'han identificat possibles funcions que podria estar exercint el complex PeBoW o bé les diferents proteïnes del complex de forma aïllada fora del prerribosoma. Així mateix es coneix que la biogènesi ribosomal és un mecanisme altament regulat i estretament relacionat amb creixement i proliferació cel·lular. La imperiosa necessitat de síntesi de ribosomes i proteïnes que té una cèl·lula tumoral converteix a aquest procés és un punt feble d'aquesta. Per aquesta raó, hi ha un gran interès per a estudiar la biogènesi ribosomal com a diana terapèutica contra el càncer. S'ha observat que la paralització d'aquesta via és capaç de promoure l'activació no genotòxica del supressor tumoral p53, a diferència dels efectes indesitjats que provoquen les teràpies convencionals contra el càncer. Com a primer pas cap al desenvolupament d'eines inhibidores de la biogènesi del ribosoma, hem utilitzat la informació cristal·logràfica que posseíem del complex de Chaetomium thermophilum entre els factors d'assemblatge Erb1 i Ytm1 per a realitzar una selecció guiada per l'estructura de pèptids d'interferència. Els pèptids d'interferència han sigut analitzats in vitro per a determinar la seua capacitat d'interacció utilitzant tècniques biofísiques. Així mateix, s'han generat pèptids d'interferència amb la seqüència humana de Erb1/Ytm1 per a avaluar els seus efectes en cultiu de cèl·lules de càncer de còlon HCT-116. Els nostres resultats indiquen que l'estrès ribosòmic es pot induir en diferents etapes del procés de maduració en dirigir-se a les interaccions proteïna-proteïna, elevant-les com una alternativa a l'ús d'inhibidors de l'ARN pol I.[EN] Ribosomal biogenesis is a complex, essential and one of the most energy-costing process in eukaryotic cells. The assembling of the ribosomal subunits, in yeast, starts with the RNA transcription inside the nucleolus. This process requires the participation of more than two hundred assembly factors and small nucleolar RNAs (snoRNAs) that will not be part of the mature ribosome, however, they are still necessary to perform the appropriate rRNA processing and structural management. The structural studies on the maturation stages of the 60S subunit have shown functional interactions between different assembling factors. In this group, we find Nop7, Erb1 and Ytm1, that both form a discrete heterotrimer called Nop7 subcomplex in yeast, or PeBoW in mammalian, composed by the respective orthologues Pes1, Bop1 and WDR12. This complex can be found isolated from the pre-ribosomal particles. The presence of this complex is crucial to the 60S subunit assembling, once it ensures the correct maturation of the 5' tip of the rRNA 5,8S, supporting the association with the 25S rRNA. Yet, the details of the PeBoW complex roll in ribosomal biogenesis remain unknown. Hereafter, there are some analysis of interaction assays between the PeBoW component proteins, as well as an approach to structural of the complex in solution. Using different biophysical techniques, the results suggest that PeBoW complex adopts a different conformation in the nucleoplasm than the described in the pre-ribosomal context. Furthermore, it hints some other functions of the PeBoW complex, or the isolated component proteins out of the pre-ribosome path. Besides that, the ribosomal biogenesis is a highly regulated process and strictly related with cellular growth and proliferation. The mandatory demand of ribosome and protein synthesis of tumoral cells make this process a weak point of it. This is the reason why ribosomal biogenesis as cancer treatment target is a point of great interest. According to some studies, it is expected that the interruption of this pathway can lead the non-genotoxic activation of the tumor suppressor p53, unlike other conventional cancer therapies. As a first step to development of ribosomal biogenesis inhibiting tools, the structural information of Erb1 and Ytm1 in Chaetomium thermophilum complex, was taken to design structure-guided interfering peptides. Using biophysical techniques, the interfering peptides were evaluated in vitro to determine their interaction ability. Then, human-sequenced Erb1/Ytm1 interfering peptides were designed to look over the effects on colon cancer cells HCT-116. The results indicate that the ribosomal stress can be induced in different stages of the maturation process, by approaching protein-protein interactions, planting it as an alternative to RNA pol I inhibitors.Este trabajo ha sido realizado con el apoyo económico de los proyectos de investigación enumerados a continuación: SAF2015-67077-R, SAF2017-89901-R y PROMETEO/2018/0 Durante el periodo de realización de esta tesis, la autora, Lidia Orea Ordóñez, ha sido beneficiaria de una subvención para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral denominada “Ayudas para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral”, (ACIF) (ACIF/2016/103), otorgada por la Generalitat Valenciana, Conselleria de Innovación, Universidades, Ciencia y Sociedad Digital, concedida en la convocatoria 2016.Orea Ordóñez, L. (2022). Estructura y función del complejo PeBoW como modelo en el desarrollo de posibles herramientas terapéuticas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/18234