Yksinkertainen nopea lateksiagglutinaatiotesti perunan Y-viruksen määrittämiseksi

A simple kit for rapid detection of potato virus Y by latex serological test was developed. The test is carried out on a white cardboard sheet and the results can be read by naked eye in two minutes. A test card of 10 x 6 cm holds latex sensitized antibodies, buffers and other necessary ingredients as dry blue colored formulate on the ringed areas of the card. A test card includes space for six tests and positive and negative controls. The kit also includes disposable plastic sticks for mixing the samples with test reagents and a hand press with disposable plastic tips. For testing, dried reagents are dissolved in drops of sample and mixed. After gentle rotation, samples containing virus appear clearly granulated while samples from healthy plants remain unagglutinated. The testing of undiluted extracts of evenly developed tuber sprouts resulted in over 91 % identity with the results obtained with ELISA that was used as a control method. Testing of diluted leaf extracts reached the same reliability but undiluted leaf extracts from glasshouse grown potatoes were not well suitable as test samples because of their dark green color. No such problems occurred with field grown material and a complete identity with the ELISA readings was true when the samples included secondarily infected potato plants. No reaction to other potato viruses than PVY was obtained by the test kit.Perunan Y-virus aiheuttaa jatkuvasti tuntuvia sadonmenetyksiä ja vähentää täten perunanviljelyn kannattavuutta. Virus rasittaa erityisesti Etelä-Suomen ruokaperunan siementuotantoa. Ainoa mahdollisuus estää virustautivahingot on käyttää tervettä siemenperunaa. Terveyden varmistamiseksi siemeneksi käytettävä peruna on testattava. Nykyinen testauslaboratoriokapasiteetti riittää vain valio- ja kauppasiemenen tutkimiseen. Ruokaperunaa tuotetaan yhä yleisesti tarkastamattomalla siemenellä, mikä on usein pahoin Y-viruksen tartuttamaa. Tilanteen korjaamiseksi tarvitaan lisää siemenperunan testauskapasiteettia, mieluiten luotettavaa yksinkertaista testiä, joka soveltuisi myös neuvonnan ja perunatilojen käyttöön. Tämä tutkimus Y-viruksen pikatestin kehittämiseksi tehtiin Maatalouden tutkimuskeskuksen ja Ani Biotech Oy:n (Helsinki) yhteistyönä. Alustavissa tutkimuksissa selvitettiin lateksiagglutinaatioperiaatteen sopivuus tarkoitukseen, minkä jälkeen valmistettiin tarkoitukseen erät vasta-aineseerumeita Y-viruksen Yn-rotua antigeeninä käyttäen. Virusmääritys tehdään valkealla pahvikortilla. Tähän muotoiltujen kohoumarenkaiden keskelle on kiinnitetty pieni sininen täplä, mikä sisältää lateksi-vasta-ainekompleksin lisäaineineen. Kortilla (10 x 6 cm) on kuusi testipaikkaa sekä lisäksi paikat positiiviselle ja negatiiviselle kontrollille. Testattaessa kuiva reagnessitäplä liuotetaan noin 30µl:n näytepisaraan ja sekoitetaan koko näyteaineelle levittäen, minkä jälkeen näyte pidetään hitaassa liikkeessä korttia käännellen. Tulos luetaan kahden minuutin kuluttua silmävaraisesti. Y-virusta sisältävät näytteet sekä positiivinen kontrolli muuttuvat rakeisiksi kun taas viruksettomat näytteet ja negatiivinen kontrolli säilyvät hienojakoisen sileinä. Testi ei reagoi perunan muihin viruksiin. Lateksitestillä päästiin yli 91 %:n yhdenmukaisuuteen ELISA-testin tulosten kanssa määritettäessä Y-virusperunan itujen puristemehusta. Virhe syntyi lähinnä joidenkin heikkojen positiivisten reaktioiden havaitsematta jäämisestä. Näytteiksi soveltuvat parhaiten pimeässä tai heikossa valossa kasvaneet mehukkaat vaaleat idut. Valossa kehittyneiden itujen violetti väri häiritsee tuloksen lukemista jonkin verran. Itämisen alussa olevia mukulanäytteitä ei pidä testata, koska viruskonsentraatio iduissa on tällöin vielä hyvin alhainen. Kasvihuoneessa kasvatettujen perunantaimien laimennetuista lehtimehunäytteistä saatiin 92 %:sti oikeat viruspositiiviset tulokset. Virus voitiin määrittää luotettavasti vielä 1:50 laimennetusta näytteestä. Sopivaksi testilaimennokseksi katsottiin kuitenkin 1:5, vaikka tällöinkin syntyi joitakin voimakkaan vihreän värin aiheuttamia virhetulkintoja. Laimentamaton lehtimehu ei soveltunut ongelmitta näytteeksi, sillä väri saattoi peittää tai naamioida vahvankin agglutinaatioreaktion tai saostua vähäisenkin kuivumisen aikana. Lehtiruodeista tai varsista saatava puristemehu soveltuu lehtimehua paremmin näytteeksi. Normaalien kasvustonäytteiden virusmäärityksistä tähän artikkeliin saatiin vasta alustavia tuloksia. Virusmääritys voitiin tehdä aina täysin luotettavasti myös laimentamattomasta lehtimehusta. Saostumareaktio oli erittäin selkeä, kun laimentamatonta mehua käytettiin minimimäärä (15—20/µl), mikä riitti peittämään tasaisesti testikortin näytetilan. Näytemäärän lisäännyttyä yli 30 µl:n reaktio heikkeni nopeasti, mikä aiheutui vasta-ainekonsentraation alenemisesta ja näin syntyvästä virus- ja vasta-ainekonsentraation epätasapainosta. Luotettavan määrityksen perusta on siten vakiotilavuuksinen näyte kortin kaikissa näytetiloissa. Kehitetty testipaketti sisältää testikorttien lisäksi muovisia kertakäyttöisiä sekoitustikkuja, pienen näytepuristimen sekä puristimen kertakäyttökärjet. Testikortit säilyvät käyttökelpoisina kuivassa viileässä paikassa vähintään vuoden. Testi soveltuu nykyisellään iduista tehtäviin määrityksiin ja myös muista kasvinäytteistä voidaan saavuttaa riittävä luotettavuus. Testiä tulisi vielä kuitenkin parantaa siten, että kasvustosta ennen nostoa otetusta versonäytteestä saataisiin luotettava tulos, jolloin viljelijä voisi hyvissä ajoin varautua mahdolliseen siemenkannan uusimiseen