Nanopartículas de conversão ascendente para terapia fototérmica e entrega de fármacos em células de melanoma

Melanoma is the most aggressive type of skin cancer with high mortality rates. It must be detected at an early stage as it can be surgically removed with a high survival rate. Although existing therapies and surgery have made great progress in recent years, melanoma continues to have a high resistance to therapies and, if discovered at an advanced stage, treatment options are scarce and of low efficacy. Upconversion nanoparticles (UCNPs) have attracted attention in this field due to their excellent properties, as for instance their ability to convert photons in the low-energy near-infrared region into high-energy radiation ranging from the ultraviolet to the visible region. These nanoparticles usually present low cytotoxicity and high luminescent stability, deep penetration into tissues and do not exhibit photobleaching. Photothermal therapy, which uses radiation to create a localized heating effect only in target areas, is a promising solution for the treatment of melanoma. Upconversion nanoparticles could be used as photothermal agents, as they absorb in the near-infrared region and do not cause damage to biological tissues (in this region, the absorption of biological tissues is minimal). Intense laser radiation can damage tissue and the nanoparticles themselves. Therefore, it is essential to determine the ideal irradiation conditions (time and power density) to generate localized heating in tumour tissues, keeping normal tissues and nanoparticles intact, to achieve optimal phototherapeutic results. Another strategy to treat only the areas affected by the disease, avoiding the appearance of side effects in other parts of the body, is the targeted delivery of drugs. In drug delivery using nanoparticles, the drug is loaded onto the nanoparticle and transported to the destination where it will be released. Upconversion nanoparticles are ideal candidates for this delivery as they can be activated by light or pH. This work aimed to evaluate the potential of different types of UCNPs for the treatment of human melanoma. It was also focused on optimizing the irradiation conditions for the application of photothermal therapy and in the study of pH-mediated loading and release of the drug doxorubicin. For that, the biocompatibility of UCNPs with different compositions was evaluated in two melanoma cell lines: MNT-1 and A375. In this evaluation, four different types of nanoparticles were used, namely, NaYF4:Lu,Yb,Er(47%,18% ,2%)@SiO2 (UCNPs@SiO2), NaYF4:Lu,Yb,Er(47%,18%,2%)@SiO2-Au (UCNPs@SiO2-Au), NaYF4:Yb,Er(20%.2%)@mSiO2-PO4 (UCNPs@mSiO2-PO4) and NaYF4:Yb,Er(20%.2%)@mSiO2-COOH (UCNPs@mSiO2-COOH). The physicochemical characterization of nanoparticles (UCNPs@SiO2 and UCNPs@SiO2-Au) was performed by Dynamic Light Scattering to evaluate their size and polydispersity index. The zeta potential was also evaluated. To assess biocompatibility, the colorimetric MTT assay (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) was performed, showing that the nanoparticles are biocompatible at almost all concentrations and exposure times tested for the MNT- 1 cell line, which is no longer seen at the highest exposure concentrations for the A375 cell line. As confirmation of the MTT assay, the Neutral Red Uptake assay was performed but only for the MNT-1 cell line and for UCNPs@SiO2. Regarding the optimization of irradiation conditions for the application of photothermal therapy, a 980nm laser was used, and the UCNPs@SiO2 and UCNPs@SiO2-Au nanoparticles were tested. The heating obtained in culture medium with and without phenol red was tested, as well as the heating obtained in water. Various power densities were tested covering a range from 0.3W/cm2 to 4W/cm2 during 15min in 96-well plates and in a cuvette. Through this study, it was concluded that the A375 cell line is more sensitive to high concentrations of nanoparticles while the MNT-1 cell line is more tolerant. It was also concluded that the functionalization of UCNPs with gold nanoparticles seems to have a negative impact on biocompatibility. About the conditions of laser irradiation, further investigation is needed so that, after determining the ideal time and power density, a photothermal therapy can be tested using in vitro cell culture. In our assays carried out with the UCNPs@mSiO2-PO4 and UCNPs@mSiO2-COOH nanoparticles, whose objective was to evaluate the loading and release of doxorubicin, it was found that the phosphonate nanoparticles load more efficiently doxorubicin in relation to the carboxylated nanoparticles and that the release of this drug occurs more quickly in more acidic environments.O melanoma é o tipo mais agressivo de cancro da pele apresentando elevadas taxas de mortalidade. É muito importante que seja detetado numa fase inicial pois pode ser removido cirurgicamente com uma taxa de sobrevivência elevada. Embora as terapias existentes e a cirurgia tenham obtido um grande progresso nos últimos anos, o melanoma continua a ter uma alta resistência às terapias e, se for descoberto num estado avançado, as opções de tratamento são escassas e de baixa eficácia. As nanopartículas de conversão ascendente (UCNPs) têm atraído atenção neste campo devido às suas excelentes propriedades, nomeadamente a capacidade de converter fotões na região do infravermelho próximo, de baixa energia, em radiação de alta energia que varia desde o ultravioleta até à região do visível. Estas nanopartículas apresentam geralmente baixa citotoxicidade e possuem alta estabilidade luminescente, não exibem fotobranqueamento e têm capacidade de penetrar profundamente nos tecidos. A terapia fototérmica, que utiliza radiação para criar um efeito de aquecimento localizado apenas nas áreas-alvo, é uma solução promissora para o tratamento do melanoma. Esta terapia usa agentes fototérmicos, que normalmente são nanopartículas de conversão ascendente, que por absorverem na região do infravermelho próximo não causam danos aos tecidos biológicos (nessa região, a absorção de radiação dos tecidos biológicos é mínima). A radiação laser intensa pode causar danos aos tecidos e às próprias nanopartículas. Por isso, é essencial determinar as condições de irradiação ideais (tempo e densidade de potência) para gerar o aquecimento localizado nos tecidos tumorais, mantendo os tecidos normais e as nanopartículas intactos, de maneira a alcançar os resultados fototerapêuticos ideais. Outra estratégia para tratar apenas as áreas afetadas pela doença, evitando o aparecimento de efeitos colaterais noutras partes do corpo, é a entrega direcionada de fármacos. Na entrega de fármacos usando nanopartículas, o medicamento é carregado na nanopartícula e transportado para o local de destino onde será libertado. As nanopartículas de conversão ascendente são candidatas ideais para esta entrega sendo frequentemente ativadas por luz ou pelo pH. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de diferentes tipos de UCNPs para o tratamento do melanoma humano. Focou-se, ainda, na otimização das condições de irradiação para aplicação da terapia fototérmica e no estudo do carregamento e libertação mediada por pH do fármaco doxorrubicina. Para tal, foi feita a avaliação da biocompatibilidade de UCNPs com diferentes composições em duas linhas celulares de melanoma: MNT-1 e A375. Nesta avaliação foram usados quatro tipos diferentes de nanopartículas: NaYF4:Lu,Yb,Er(47%,18%,2%)@SiO2 (UCNPs@SiO2), NaYF4:Lu,Yb,Er(47%,18%,2%)@SiO2-Au (UCNPs@SiO2-Au), NaYF4:Yb, Er(20%,2%)@mSiO2-PO4 (UCNPs@mSiO2-PO4) e NaYF4:Yb,Er(20%,2%)@mSiO2-COOH (UCNPs@mSiO2-COOH). A caracterização físico-química das nanopartículas (UCNPs@SiO2 e UCNPs@SiO2-Au) foi feita por Dispersão Dinâmica da Luz de maneira a avaliar o seu tamanho e o índice de polidispersão. O potencial zeta também foi avaliado. Para avaliar a biocompatibilidade, foi realizado o ensaio colorimétrico de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) mostrando que as nanopartículas são biocompatíveis em quase todas as concentrações e tempos de exposição testados para a linha celular MNT-1, facto que já não se verifica nas concentrações de exposição mais elevadas para a linha celular A375. Como confirmação do ensaio de MTT, foi realizado o ensaio Neutral Red Uptake mas apenas para a linha celular MNT-1 e para as UCNPs@SiO2. No que diz respeito à otimização das condições de irradiação para aplicação da terapia fototérmica, foi usado um laser de 980nm e testadas as nanopartículas UCNPs@SiO2 e UCNPs@SiO2-Au. Testou-se o aquecimento obtido em meio de cultura com e sem vermelho de fenol bem como o aquecimento obtido em água. Várias densidade de potência foram testadas abrangendo um intervalo de 0,3W/cm2 a 4W/cm2 durante 15min em placas de 96 poços e em cuvete. Através destes estudos conclui-se que a linha celular A375 é mais sensível às altas concentrações de nanopartículas, enquanto que a linha celular MNT-1 é mais tolerante. Conclui-se, também, que a funcionalização das UCNPs com nanopartículas de ouro parece ter impacto negativo na biocompatibilidade. No que diz respeito às condições de irradiação do laser, mais investigação é necessária de maneira a que, após se determinar o tempo e a densidade de potência ideais, a terapia fototérmica possa ser testada utilizando cultura de células in vitro. Nos testes efetuados com as nanopartículas UCNPs@mSiO2-PO4 e UCNPs@mSiO2-COOH, cujo objetivo foi avaliar o carregamento e libertação da doxorrubicina, constatou-se que as nanopartículas fosfonadas carregam mais eficientemente a doxorrubicina em relação às nanopartículas carboxiladas e que a libertação deste fármaco ocorre mais rapidamente em meios mais ácidos.Mestrado em Biologia Molecular e Celula