Synthèse chimioenzymatique d'analogues de monosaccharides utilisés comme sondes pour le développement d'un test de sélection de la transcétolase de Saccharomyces cerevisae basé sur l'auxotrophie

Transketolase (TK) catalyses the D-threo ketose synthesis by stereospecific formation of a C-C bond. The objective of this work consisted in modifying the substrate specificity of TK from Saccharomyces cerevisiae by mutagenesis to extend the synthetic potential to D-threo aldoses and Lerythro ketoses. Our strategy was based on the creation of TK libraries from TKL1 gene short sequences (identified from 3D structure) using cassette mutagenesis techniques. For identifying desired TK, we developed an in vivo selection test based on amino acid auxotrophy. Consequently, we synthesised corresponding probes bearing a moiety recognised by wild type TK (D-threo ketose) or mutant TK (L-erythro ketose or D-threo aldose) and the side chain of an amino acid (alanine, valine, leucine, methionine, threonine). We investigated this selection test in the presence of D-threo ketoses and wild type TK. In vitro we showed that these compounds were substrates for TK. Concerning the in vivo test, we chose leucine and methionine precursors due to the tightness and stability of E. coli auxotrophs. The higher growth rates were obtained with D-threo ketose probe, precursor of methionine.La transcétolase (TK) permet de synthétiser des cétoses D-thréo par formation stéréospécifique d'une liaison C-C. L'objectif de ces travaux vise à modifier la spécificité de substrat de la TK de Saccharomyces cerevisiae par mutagenèse afin d'élargir le potentiel synthétique aux aldoses D-thréo et cétoses L-érythro. Notre stratégie a consisté à créer des banques de TK mutées à partir de courtes séquences du gène TKL1 (identifiées d'après la structure 3D) qui ont été dégénérées grâce à une approche de type "cassette mutagenesis". Pour identifier les TK recherchées, nous avons développé un test de sélection in vivo basé sur l'auxotrophie vis-à-vis d'un acide aminé. Dans ce but, nous avons synthétisé des sondes appropriées comportant un motif reconnu par la TK naturelle (cétose D-thréo) ou par les TK mutées recherchées (cétose L-érythro ou aldose D-thréo) et la chaîne latérale d'un acide aminé (alanine, valine leucine, méthionine, thréonine). La faisabilité de ce test a été étudiée en présence des composés cétose D-thréo et de la TK sauvage. In vitro, nous avons montré que ces différents composés sont des sustrats de la TK. Pour le développement du test de sélection in vivo dans E. coli, les substrats précurseurs de la leucine et la méthionine ont été retenus en raison de la stabilité de l'auxotrophie pour ces acides aminés. Les meilleurs taux de croissance ont été obtenus avec la sonde cétose D-thréo précurseur de la méthionine