CRISPR/Cas9 in mollicutes : From natural systems towards tools for genome engineering

Les systèmes CRISPR/Cas sont largement représentés chez les bactéries et les archées et sont à la base de mécanismes de défense adaptatifs contre l’ADN et l’ARN exogène. De par son intérêt comme outil génétique, le système CRISPR de type II de Streptococcus pyogenes a été particulièrement étudié. Il est composé principalement d’une endonucléase Cas9 et d’un sgRNA qui a pour rôle de guider Cas9 jusqu’à une séquence cible, la spécificité de reconnaissance dépendant également d’une séquence NGG située en aval appelée PAM. Les mollicutes sont des bactéries minimales, dépourvues de paroi et qui utilisent, pour la plupart, un code génétique alternatif. Elles possèdent de petits génomes riches en AT (~70-75%) allant de 0,58 à 2,2 Mpb. La plupart d’entre elles ont un mode de vie parasitique et sont des pathogènes d’une grande diversité d’hôtes (plantes et animaux y compris humains). Chez la plupart des mollicutes, les possibilités d’ingénierie génomique restent limitées car la recombinaison homologue est peu efficace. Le but de ma thèse a été de (1) caractériser les systèmes CRISPR//Cas9 des mollicutes, (2) développer un outil endogène CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie de génome de mollicutes et (3) d’étendre cette boite à outils chez certaines espèces d’intérêt pour lesquelles aucun outil génétique de précision n’était disponible.La première partie de mon travail de thèse était l’étude globale des systèmes CRISPR chez les mollicutes. Une reconstruction phylogénétique a permis de mettre évidence une origine commune pour tous les systèmes CRISPR de mycoplasmes et deux origines pour les systèmes de spiroplasmes. L’étude structurale de la protéine Cas9 des mollicutes montre une forte proximité structurale avec la protéine Cas9 de Staphylococcus aureus à l’exception du domaine PI qui intervient dans l’interaction avec la séquence PAM, ce qui suggère que les séquences PAM des systèmes de mollicutes sont sans doute très différentes. Le système CRISPR/Cas9 de Mycoplasma gallisepticum (Mgal), un pathogène d’oiseau, a ensuite été l’objet d’une étude approfondie. Le système naturel a été démontré comme fonctionnel in vivo et le système minimal composé de la MgalCas9 et d’un sgRNA a permis d’induire un clivage de l’ADN in vitro. Une différence de séquence PAM consensus a été observée entre deux souches de Mgal isolées de poulet et de pinson et a pu être mise en corrélation avec le récent changement d’hôte du pathogène et l’émergence de celui-ci dans les populations de pinsons d’Amérique. Un plasmide « all-in-one » contenant le système a été conçu, et la fonctionnalité du système comme outil précis de clivage a été démontré dans différentes espèces, notamment Mgal, Mycoplasma capricolum (Mcap), Mycoplasma pulmonis et Mycoplasma mycoides. Cet outil de contre sélection a été appliqué à Mcap afin de curer son génome d’un élément mobile intégré de 23 kpb (ICE). Finalement, pour pallier à la faible efficacité de recombinaison des mycoplasmes, deux nouveaux outils d’ingénierie génomique ont été mis au point. Un outil « CRISPR Base Editor », composé d’une protéine Cas9 désactivée, fusionnée à une protéine de type déaminase, qui permet de faire des modifications de base de manière très ciblée. La fonctionnalité de cet outil, très efficace et simple d’utilisation, a été validée dans 3 espèces pathogènes majeures de mycoplasmes. Le second outil est basé sur l’importation d’un système de recombinaison RecET issu de phages. Chez Mgal, cet outil d’ingénierie de génome permet ainsi pour la première fois de réaliser des modifications précises à plus grande échelle (délétions, insertions et remplacements).En conclusion, nos travaux ont concerné l’étude fonctionnelle des systèmes CRISPR des mycoplasmes et le développement d’outils d’ingénierie de génomes chez ces mêmes bactéries. Ce travail ouvre de manière significative les possibilités d’étude et d’utilisation des mycoplasmes pour des applications biotechnologiques.CRISPR/Cas systems are widely represented in bacteria and archaea and provide them an adaptative defense mechanism against exogenous DNA or RNA. Because of its wide use as a genome engineering tool, type II CRISPR system from Streptococcus pyogenes has been extensively studied. The core system includes the endonuclease Cas9 and one sgRNA that drives Cas9 on a target site with a recognition specificity depending on the NGG Protospacer Adjacent Motif (PAM). Mollicutes are minimal bacteria that have no cell wall and most of them use an alternative genetic code. Their genomes are AT rich (~70-75%) with a size ranging from 0.58 to 2.2 Mbp. Most of them have a parasitic lifestyle and are pathogens of a wide host diversity including humans, other animals and plants. For most mollicutes species, genome engineering currently remains challenging mainly because homologous recombination is poorly efficient. The aim of my thesis was to (1) characterize CRISPR/Cas9 systems of mollicutes, (2) develop a genome engineering tool based on endogenous CRISPR/Cas9 system and, (3) extend the toolbox for some mycoplasmas of veterinary interest for which any precise genetics tool was available.The first part of my thesis work was a global survey of CRISPR systems in mollicutes. Complete or degraded CRISPR systems were found in 21 out of the 52 representatives mollicutes species included in the study. Phylogenetic reconstruction indicated a probable unique origin of mycoplasma CRISPR/Cas9 systems while two different origins were predicted for systems present in spiroplasmas. Comparison of the predicted structures Cas9 from mollicutes and Staphylococcus aureus showed a strong structural proximity except for the PI domain that is involved in the interaction with the PAM sequence. This suggests probable differences of PAM recognition specificity. We next focused on the CRISPR/Cas9 system of the bird pathogen Mycoplasma gallisepticum (Mgal). The functionality of the system was demonstrated in vivo and a minimal system including Cas9 and a sgRNA was designed and evaluated in vitro. An extensive evaluation of the PAM motifs recognized by two MgalCas9 from two distinct strains of Mgal isolated in chicken and house-finch was conducted using an in vitro cleavage assay coupled with a deep sequencing strategy. A difference of PAM consensus was observed between the two strains and was correlated with a recent host jump from chicken to American house-finch. Next, a set of “all in one” plasmids was constructed and MgalCas9 was successfully used as a tool for precise DNA cleavage in different mycoplasma species: Mgal, Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (Mcap), Mycoplasma pulmonis et Mycoplasma mycoides subsp. mycoides. Using this counter selection tool, we were able to cure the Mcap genome from a 23 kbp auto-excisable genetic mobile element (ICE). In order to overcome the low efficiency of natural recombination in mycoplasmas that limits genome engineering possibilities, I developed two new generations tools. The first one is a “CRISPR Base Editor” consisting in an inactivated Cas9 protein that is fused to a deaminase protein (pmcDA1). This hybrid enzyme allowed very specific base modification in the mycoplasma genome. This simple tool was demonstrated to be highly efficient in three main pathogenic mycoplasmas, opening new possibilities for their study. The second tool is based on the phage recombination system RecET that was used to drive homologous recombination in mycoplasma. For the very first time in Mgal, this tool allowed us to perform large scale and precise modifications (Insertion, deletion and replacement).In conclusion, my PhD thesis was dedicated to the studies of CRISPR system of mycoplasma and the development of new precise genome engineering tools for these bacteria. This work opened unprecedent possibilities for the study of pathogenic mycoplasmas and further biotechnological applications