Characterisation of new protein partners and development of Nanobodies, specific to the protein BILBO1, a major component of the flagellar pocket of the parasite Trypanosoma brucei.

Le trypanosome est un parasite protiste unicellulaire flagellé appartenant à l’ordre des Kinétoplastidés et transmis par l’intermédiaire d’un vecteur, la mouche tsé-tsé (Glossina sp.). Certaines espèces, dont Trypanosoma brucei, sont des pathogènes majeurs responsables de la trypanosomiase humaine ou « Maladie du sommeil » et animale. Ces dernières années, les avancées de la recherche ont apporté des connaissances majeures sur la biologie du parasite et des maladies associées. Mais le besoin de nouveaux traitements et d’outils de diagnostic reste une priorité (www.who.int), aucun vaccin n’étant disponible à ce jour. De plus, ce parasite unicellulaire s’avère être un excellent modèle d’étude cellulaire, son génome est séquencé, annoté et les protéines associées localisées (http://tryptag.org/). Il est utilisé comme modèle dans l’étude des anomalies de l’appareil flagellaire chez le spermatozoïde, ainsi que dans l’étude des ciliopathies chez l’Homme. Le trypanosome possède une invagination caractéristique de sa membrane plasmique au niveau de la région postérieure appelée la poche flagellaire (FP). Cet organite unique est maintenu par un collier appelé collier de la poche flagellaire (FPC) qui est le site exclusif d’endocytose et d’exocytose de ce parasite et, contribue au mécanisme d’échappement du système immunitaire. En 2008, la protéine du cytosquelette BILBO1, premier composant du FPC, a été découverte par l’équipe du Dr. D. Robinson et du Dr. M. Bonhivers.Les objectifs de ma thèse ont été d’une part d’identifier et de caractériser de nouvelles protéines partenaires de BILBO1 et d’autre part de développer des Nanobodies comme nouveaux outils d’étude de cette protéine. Nous avons pu, dans un premier temps, identifier et sélectionner dix nouvelles protéines partenaires de BILBO1 par l’utilisation de la technique de double hybride chez la levure puis, dans un deuxième temps, réaliser une caractérisation fonctionnelle de ces partenaires en combinant deux approches : l’étiquetage endogène et la diminution du niveau d’expression protéique par ARN interférent (ARNi). Cette première étape nous a menés à l’identification de plusieurs candidats dont une nouvelle protéine dénommée TFK1 (Transition fibres Kinetoplastid specific protein 1). En développant de nouvelles techniques dont la microscopie d’expansion (ExM), nous avons pu montrer que TFK1 était localisée au niveau du corps basal mature, et plus précisément dans une région encore peu connue chez le trypanosome, les fibres de transition (FT). L’utilisation de l’ARNi a montré que TFK1 était essentielle chez la forme différenciée du parasite (ou bloodstream form) responsable de l’infection chez les mammifères et engendrait un changement drastique dans la morphologie du parasite lors de sa division. Ces résultats, nous permettent de proposer une fonction de la protéine TFK1 dans l’initiation et la mise en place du sillon de division cellulaire lors de la cytokinèse du parasite.Le second objectif de ma thèse a été le développement de Nanobodies comme nouveaux outils moléculaires dans l’étude de la protéine BILBO1. Nous avons pu d’abord identifier et sélectionner un Nanobody, le Nb48 spécifique de la protéine BilbO1. Nous avons pu le produire, le purifier et valider son utilisation comme outil d’étude par les techniques de western blot et d’immunofluorescence. Nous avons également pu démontrer son utilisation en tant qu’Intrabody (iNbs) capable de bloquer la fonction de la protéine BILBO1 lorsqu’il est exprimé dans le cytoplasme du parasite. L’utilisation des Nbs étant en très forte expansion ces dernières années, que ce soit en biologie moléculaire et cellulaire, en microscopie, en diagnostique et en thérapeutique, nos résultats ouvrent la voie à de nouvelles approches chez le trypanosome et pour d’autres pathogènes.The trypanosome is a unicellular flagellated protist parasite belonging to the order Kinetoplastida and transmitted to the intermediate host by the vector, the tsetse fly (Glossina spp.). Certain species, such as Trypanosma brucei, are major pathogens responsible for human trypanosomiasis or “Sleeping Sickness” and animal trypanosomosis. In recent years, the advances in research has greatly enhanced our knowledge of the biology of the parasite and the associated diseases. However, the need for new treatments and diagnostic tools rest a priority (www.who.int), to this date, no vaccine is available. In addition, this unicellular parasite proves to be an excellent cell biology study model, its genome is sequenced and annotated and the associated proteins are localised (http://tryptag.org/). Trypanosomes are used in studies of abnormalities of the flagllar apparatus in spermatozoa, as well as in studies of human ciliopathies. The trypanosome possesses a characteristic invagination of the plasma membrane in the posterior region called the flagellar pocket (FP). This unique organelle is maintained by a structural collar called the flagellar pocket collar (FPC) which is the exclusive site of endocytosis and exocytosis for the parasite and contributes to the mechanism by which the parasite escapes the host immune system. In 2008, the cytoskeletal protein BILBO1, was the first component of the FPC to be discovered by the team of Dr D. Robinson and Dr M. Bonhivers.The objectives of my thesis were in one part to identify and characterise ew protein parteners of BILBO1 and in the other part to develop Nanobodies as new tools to study this protein. Firstly, ten new protein partners of BILBO1 were identified by the use of the double hybrid technique in yeast, next functional characterisation of these partners was carried out by combining two approaches: endogenous labelling and reduction of protein expression using RNA interference (RNAi). This first stage, led to the identification of numerous candidates, including a new protein called TFK1 (Transition Fibres Kinetoplastid specific protein 1). In developing new microscopy techniques, specifically expansion microscopy (ExM), I have shown that TFK1 is localised at the level of the mature basal body and more precisely in a region less known in trypanosomes, the transition fibres (TF). The use of RNAi showed that TFK1 was essential in the bloodstream form of the parasite responsible for infection in mammals and engendered a dramatic change in the morphology of the parasite during its division. This result, allows the proposition of a function for the protein TFK1 in the initiation and establishment of the cell division groove during cytokinesis of the parasite.The second objective of my thesis was the development of the use of Nanobodies as new molecular tools to study the protein BILBO1. We were first able to identify and select a Nanobody, Nb48, specific to the protein BILBO1. We were able to produce, purify and validate its use as a tool to study BILBO1, by western blotting and immunofluorescence techniques. We were also able to demonstrate its use as an intrabody (iNb) capable of blocking the function of the protein BILBO1 when it was expressed in the cytoplasm of the parasite. The use of Nanobodies has greatly expanded in recent years, in molecular and cellular biology, microscopy, diagnostics and therapy. Our results open a path to new approaches within trypanosomes and for other pathogens