Genomic contextualization of heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa isolates

Programa Doutoral em Biologia Molecular e Ambiental (Especialidade em Biologia Celular e Saúde)Esta tese de doutoramento, com base numa colaboração com o Hospital de Braga, teve como principais objetivos: i) fornecer uma caracterização sistemática dos isolados de P. aeruginosa, agrupandoos de acordo com o seu genótipo; ii) sequenciar e comparar o genoma de isolados representativos; e iii) compreender a sua subjacente heterogeneidade fenotípica. A análise dos genótipos com base na separação dos produtos de PCR em gel foi padronizada a fim de avaliar a diversidade genética da coleção e estabelecer um estudo rápido e barato, possibilitando uma monitorização contínua dos isolados clínicos. Mais de 700 isolados foram avaliados e agrupados em 14 grupos, sem associação com determinado fenótipo ou origem. Os nossos dados sugerem que as numerosas infeções por P. aeruginosa diagnosticadas no Hospital de Braga foram causadas por organismos geneticamente distintos, sem evidências de qualquer evento pandémico. Para abordar a questão de saúde pública da multirresistência a antibióticos, três isolados da nossa coleção, resistentes à colistina, foram sequenciados. O estudo de genómica comparativa identificou novos fatores genómicos potencialmente envolvidos neste fenótipo de resistência. De um subpainel de P. aeruginosa que visava associar o genótipo ao fenótipo, destacaram-se dois isolados associados a pacientes diagnosticados com pneumonia, agrupados no mesmo grupo genotípico, mas com características fenotípicas contrastantes. A avaliação do seu potencial patogénico em células epiteliais pulmonares enfatizou a importância de fatores bacterianos excretados na modulação da resposta imune do hospedeiro, e sugeriu uma origem de fases de infeção pulmonar distintas. A identificação e comparação do seu conteúdo genómico corroborou estas associações, destacando a grande diversificação genómica entre estirpes de P. aeruginosa. A análise de toda a componente extracelular do proteoma, permitiu a identificação de características únicas de função desconhecida como possíveis novos determinantes patogénicos e de resistência a antibióticos. Ademais, características associadas à resposta à luz também evidenciaram variações, sugerindo uma potencial capacidade diferencial de suportar a exposição aos raios UV. Desta forma, foi avaliado o impacto da exposição à luz, sugerindo um maior potencial patogénico para P. aeruginosa cultivada no escuro. Uma abordagem proteómica permitiu associar o padrão obtido quando crescido na presença contante de luz a uma resposta de stresse oxidativo. Extrapolando as estratégias seguidas nesta tese para outros isolados clínicos de P. aeruginosa e integrando dados de genómica, proteómica e transcriptómica com o quadro clínico, melhorará a capacidade de entender as interações patógeno-hospedeiro e as bases moleculares das infeções bacterianas. Em última análise, uma maior compreensão da resposta adaptativa de P. aeruginosa em fases distintas da infeção pode auxiliar na descoberta de novos biomarcadores e no desenvolvimento de novos tratamentos, a fim de superar as infeções causadas por Pseudomonas aeruginosa.The main aims of this thesis, based on a collaboration with Hospital de Braga, were to: i) provide a systematic characterization of P. aeruginosa isolates by clustering according to their genotype; ii) determine and compare the genome sequence of representative isolates; and iii) understand the underlying phenotypic heterogeneity among selected isolates. A PCR-based genotyping gel profiling pipeline was standardized to evaluate its genetic diversity and establish a rapid and inexpensive screening, allowing the continuous monitoring of clinical isolates. Over 700 isolates were screened and clustered into 14 genotypic groups with no clear association with a phenotype or source. Our data suggests that the numerous P. aeruginosa infections being diagnosed in Hospital de Braga, were caused by genetically distinct organisms and no evidence of pandemic events has been registered. Tackling the public health issue of multidrug-resistance, three colistin-resistant isolates from our collection were sequenced and comparative genomics analysis have identified new genome-wide factors that could putatively be involved in this resistance phenotype. From a subpanel of P. aeruginosa isolates that aimed to link genotype to phenotype, two pneumoniaassociated isolates HB13 and HB15, clustered in the same RAPD-PCR group and evidencing contrasting phenotypic traits, were selected for evaluation of pathogenic potential towards pulmonary epithelial cells. Besides emphasizing the importance of bacterial secreted factors in modulating host innate immune responses, the results suggested possible distinct pulmonary infection stages for the two Pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Genomic contextualization further corroborated these associations, highlighting the wide genomic diversification occurring within P. aeruginosa strains. Secretome analysis identified signatures features with unknown function as potential novel pathogenic and antibiotic resistance determinants. Moreover, features associated with light response also evidenced variations in these two clinical isolates, hinting a potential differential ability to sustain UV exposure. Therefore, the impact of light exposure on the pathogenic potential was evaluated, suggesting a higher pathogenic potential of P. aeruginosa when grown under complete absence of light. A proteomics approach associated the pattern obtained when grow in constant exposure to full-spectrum light with an oxidative stress response. Expanding the strategies followed in this thesis to other P. aeruginosa clinical isolates and integrating data from genomics, proteomics and transcriptomics with the clinical outcome will improve the ability to understand host-pathogen interactions and the molecular basis of bacterial infections. Ultimately, an improved understanding of the P. aeruginosa adaptive response in distinct infection stages may aid in finding new biomarkers and developing therapeutic strategies to overcome Pseudomonas aeruginosa infections.This work was mainly funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal through the PhD grant SFRH/BD/98558/2013 and by the strategic program UID/BIA/04050/2013 (POCI-01-0145- FEDER-007569) funded by national funds through the FCT I.P. and by the ERDF through the COMPETE2020 – Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI)