Etudes biophysiques et structurales de la RNase P et des ARN aptamères

La recherche dans cette thèse de Ph.D. fait partie d'un effort continu d'améliorer notre compréhension de la structure et de la stabilité de l'ARN : Dans la première partie, un aptamer d'ARN est étudié en complexe avec sa cible, le domaine Sec7 de la protéine intracellulaire cytohesin-1. Aptamers sont des molécules d'ARN sélectionnées in vitro qui ont une affinité rivalisant celle des anticorps monoclonaux, qui possèdent des propriétés pharmacologiques intéressantes et sont un outil puissant pour l'analyse fonctionnelle in vivo. Nous présentons également une recherche structurale systématique sur la façon dont les aptamers et leurs analogues naturelles se fixent sur leurs ligands afin de tracer des principes communs. Dans la deuxième partie, nous étudions le repliement de la RNase P prokaryotique induit par les counterions en utilisant la technique des fontes UV, avec comme but l'optimisation de la structure secondaire et tertiaire en vue de la cristallisation. Nous démontrons l'utilité de cette méthode tout d'abord dans deux cas d'exemple: Premièrement, des paramètres thermodynamiques sont extraits à partir du complexe dit de 'kissing', une interaction tertiaire typique présent dans de nombreux ARNs structurés. Ceci mène à la découverte que la dépendance de la temperature de fusion de la concentration ionique peut donner des indications sur la nature des transitions structurelles observées. Deuxièmement, nous étudions l'effet de mutations sur un ARN plus complexe, le site d'entrée du ribosome (IRES) du virus de l'hépatite C, et corrélons nos données de fonte UV avec un équilibre dynamique entre deux structures alternatives identifiées par empreinte chimique. Les leçons apprises de ces expériences sont alors appliquées à la RNase P pour perturber des interactions tertiaires spécifiques afin de faciliter la cristallisation. L'effet de ces mutations est étudié en utilisant la fonte UV et une nouvelle technique basée sur des oligonucléotides fluorescentes que nous développons. Finalement, des matrices de cristallisation pour la RNase P sont construits à partir de méthodes de plannification expérimentale, et une nouvelle approche pour la cristallisation en gels est développée.The research in this Ph.D. thesis is part of an ongoing effort to improve our understanding of RNA structure and stability: In the first part, an RNA aptamer is studied in complex with its target, the Sec7 domain of intracellular protein cytohesin-1. Aptamers are in vitro selected RNA molecules that have an affinity rivaling that of monoclonal antibodies, possess interesting pharmacological properties and are a powerful tool for functional analysis in vivo. We also present a systematic structural investigation of how aptamers and their natural counterparts bind their ligands in order to delineate common principles. In the second part, we study the counterion-induced collapse of prokaryotic RNase P RNAs by UV melting, with the goal of optimizing secondary and tertiary structure for crystallization. We demonstrate the utility of this method in two test cases: First, thermodynamic parameters are extracted from the kissing complex, a typical tertiary interaction found in many RNAs. This leads to the discovery that the ionic strength dependence may give clues about the structural transitions observed. Second, we study the effect of mutations on a more complex RNA, the IRES site of hepatitis C virus, and correlate UV melting data to a dynamic equilibrium between alternative structures. The lessons learned from these experiments are then applied to RNase P to disrupt specific tertiary interactions to facilitate crystallization. The effect of these mutations is investigated using both UV melting and a novel, fluorescence-based approach. Finally, crystallization screens are constructed using methods of experimental design, and a new approach for crystallization in gels is developed