The redox pathway in mitochondrial c-type cytochromes maturation,Study of the Arabidopsis thaliana CCMH protein

La principale fonction des mitochondries est la synthèse d'énergie pour la cellule eucaryote sous forme d'ATP. Cette synthèse se fait au niveau de la membrane interne mitochondriale grâce à l'ATP synthase qui utilise le gradient de protons créé par la chaîne respiratoire, un ensemble de complexes multiprotéiques. Cette chaîne respiratoire mitochondriale comporte de nombreux transporteurs d'électrons contenant différents types de cofacteurs. Parmi ces transporteurs, les cytochromes de type c possèdent un cofacteur hémique qui est attaché de façon covalente sur les deux cystéines du motif CXXCH de l'apocytochrome. Dans les mitochondries, deux cytochromes de type c sont présents, le cytochrome c1 qui fait partie du complexe III et le cytochrome c qui transfère les électrons du complexe III au complexe IV. Ces deux protéines sont respectivement orientée ou localisée dans la membrane interne vers l'espace inter-membranaire.Les cytochromes de type c sont présents dans tous les organismes des procaryotes aux eucaryotes. Différentes étapes sont nécessaires à la biogenèse de ces hémoprotéines :le transport des apocytochromes et de l'hème vers le périplasme, l'espace intermembranaire ou le lumen selon les cas,le maintien sous forme réduite des groupements sulfhydrils des apocytochromes et du fer de l'hème,l'établissement d'une liaison covalente entre l'hème et l'apocytochrome.Trois voies de maturation des cytochromes de type c ont été mises en place au cours de l'évolution, l'une est présente chez certaines bactéries à Gram négatif (système I), l'autre chez les chloroplastes et les bactéries à Gram positif (système II), la troisième dans les mitochondries de levure et d'autres eucaryotes animaux (système III) (1). Dans les mitochondries de levure, l'assemblage de l'hème sur chaque apocytochrome est réalisé par une seule protéine, la cytochrome c hème lyase' pour le cytochrome c et la cytochrome c1 hème lyase' pour le cytochrome c1. Aucun équivalent de ces hème lyases n'a été identifié dans les mitochondries de plantes. Par contre, chez les plantes terrestres, le génome mitochondrial code pour quatre ou cinq protéines présentant de fortes similarités avec certaines protéines Ccm (pour " cytochrome c maturation ") bactériennes (3-7). Chez Escherichia coli, organisme modèle pour le système I, 8 gènes ccm, organisés en opéron, sont impliqués dans les différentes étapes de la maturation des cytochromes de type c. Les gènes ccm codent pour un ABC-transporteur, une voie de livraison de l'hème contenant une protéine chaperon d'hème, une hème lyase potentielle et une voie de réduction composée d'une thioredoxine (CcmG) et d'une thiol-disulfide oxydoréductase (CcmH) qui transfèrent les électrons à l'apocytochrome (2).Le génome mitochondrial d'Arabidopsis thaliana ne codant que pour 3 des protéines Ccm orthologues d'E. coli, d'autres gènes ont été recherchés dans le génome nucléaire d'A. thaliana. Ainsi, au laboratoire, deux nouvelles protéines CCM d'A. thaliana, codées par le génome nucléaire puis importées dans les mitochondries, ont été identifiées et étudiées. Il s'agit d'AtCCME, un chaperon de l'hème impliqué dans la voie de livraison de l'hème (8) et d'AtCCMA, le domaine de fixation de l'ATP de l'ABC-transporteur (9).Le travail réalisé au cours de cette thèse a eu pour but d'isoler et de caractériser la protéine homologue à CcmH dans la voie de maturation des cytochromes c qui est spécifique aux mitochondries végétales. La protéine bactérienne CcmH est une protéine périplasmique indispensable à la formation d'holocytochrome c. Cette protéine serait directement impliquée dans la réduction des groupements thiols des cystéines de l'apocytochromes (10). CcmH est une protéine bipartite chez E. coli, la partie N-terminale d'EcCcmH est homologue à la protéine CycL'de Bradyrhizobium japonicum et possède le site actif contenant le motif RCXXC. La partie C-terminale d'EcCcmH n'est pas indispensable pour la formation d'holocytochromes. [...]The main function of mitochondria is the synthesis of energy for the whole cell. This is done by the ATP synthase that utilises the proton gradient resulting from the activity of the respiratory chain. This respiratory chain is composed of multiprotein complexes that contain several electron transporters. c-type cytochromes are electron carriers that possess a heme as cofactor. They are characterised by the covalent attachment of this heme to two cysteinyl residues of the apocytochrome via two thioether bonds. In mitochondria, there are two c-type cytochromes : cytochrome c1 a component of complex III and cytochrome c that transfers electrons from complex III to complex IV. In these two proteins, the cofactors are respectively facing the inter-membrane space or present in the inter-membrane space.c-type cytochromes are present in all organisms from prokaryotes to eukaryotes. The biogenesis of these hemoproteins requires different steps :the transport of both apycytochrome and heme to the periplasm, inter-membrane space or lumen,the reduction of heme and cysteines of apocytochromes,the covalent ligation of heme to apocytochromes.Three distinct systems have evolved to achieve the conversion of apocytochromes to their holoforms (1). One is found in some Gram negative bacteria (system I), the second in chloroplast and Gram positive bacteria (System II) and the last in yeast and animals mitochondria (System III). In yeast mitochondria, a single protein, cytochrome c heme lyase is required for the assembly. No equivalent of heme lyase was found in plant mitochondria. Plant mitochondrial genomes encode four or five proteins similar to bacterial Ccm (for " cytochrome c maturation ") proteins (3-7). In Escherichia coli, 8 ccm genes, organised in one operon, encode the proteins needed for the maturation of c-type cytochromes. This system involves an ABC-transporter, a heme delivery pathway, a putative heme lyase and a reducing pathway composed by CcmG, a thioredoxin and CcmH a thiol-disulfide oxidoreductase that transfers electrons to the apocytochrome (2).The mitochondrial genome of Arabidopsis thaliana encodes 3 orthologues of E. coli Ccm proteins. Other Ccm genes were searched on the nuclear genome. Two were identified in the laboratory and found to be imported into mitochondria. These are AtCCME, a heme chaperone involved in the heme delivery pathway (8) and AtCCMA, the ATP binding subunit of the ABC transporter (9).The aim of this thesis was to identify and study the plant counterpart of ccmH, a component of the reducing pathway. In bacteria, CcmH is a periplasmic thiol:disulfide oxidoreductase involved in the reduction of two cysteines of the heme-binding motif of apocytochromes (10). CcmH is a bipartite protein in E. coli, the N-terminal part of EcCcmH is homologuous to the Bradyrhizobium japonicum CycL protein and possesses as active site for redox activity the RCXXC motif. The C-terminal part of EcCcmH is not necessary for the formation of holocytochromes.[...