Structural and functional studies of TonB-dependent receptors of Gram-negative bacteria

Le fer est un élément important de plusieurs métabolismes et fonctions physiologiques. Il possède la propriété de gagner ou de perdre facilement un électron, passant ainsi de la forme ferreuse (Fe2+) à la forme ferrique (Fe3+), et inversement. C est cette propriété qui lui confère un rôle primordial dans les phénomènes d'oxydations et de réductions biologiques. Bien qu'il soit très abondant dans la croûte terrestre, le fer est très peu soluble en milieu aérobie et à pH physiologique et est de ce fait est très peu biodisponible. La concentration de Fe3+ libre dans l'environnement est d'environ 10-18 M, bien trop basse pour les bactéries pathogènes qui exigent une concentration de l'ordre de 10-5 à 10 7 M pour établir et maintenir une infection. Pour contourner le problème de la faible disponibilité de fer, les bactéries ont développé différents mécanismes d'acquisition de ce métal. Le mécanisme le plus répandu implique la synthèse et la sécrétion des sidérophores, ayant une très forte affinité pour le Fe3+. Après leur sécrétion, les sidérophores chélatent le Fe3+ dans le milieu extracellulaire et le transportent au travers de la membrane externe via les récepteurs TonB-dépendants (RTBDs). Les RTBDs sont également impliqués dans le transport d'autres molécules comme l'hème. Durant cette thèse nous nous sommes intéressés à l'étude structurale des RTBDs de différentes bactéries à Gram-négatif et aussi au devenir, au niveau du périplasme, de la ferri-pyoverdine, après son transport à travers la membrane externe via le RTBD FpvA chez P. aeruginosa. Pour les études structurales, nous nous sommes intéressés à 4 RTBDs (ShuA, SuxA, FauA et FetA). Nous avons défini et optimisé un protocole de surexpression, de purification et de cristallisation pour les RTBDs. Le protocole mis en place est rapide, efficace et reproductible. Il nous a permis de purifier, de cristalliser rapidement et de collecter des données de diffraction pour 4 RTBDs. La structure de ShuA a ensuite été résolue à 2,6 °A, celle de FauA à 2,3 °A de résolution par le Dr D. Cobessi. Celle de FetA est actuellement en cours d'affinement à 3,2 °A. Pour les études fonctionnelles, nous nous sommes intéressés à l'implication des gènes du luster fpvCDEFGHJK dans l'acquisition du fer par la voie Pvd chez P. aeruginosa. Ce cluster est conservé chez toutes les espèces de Pseudomonas produisant la Pvd, il est organisé en 2 opérons, fpvCDEF et fpvGHJK, séparés par 32 paires de bases. Les résultats obtenus pendant cette thèse, suggèrent l'implication des protéines FpvCDEF dans la dissociation périplasmique de la ferri-pyoverdine par réduction du Fe3+ en Fe2+. En effet, la mutation de ces gènes abolie complètement le transport du fer par la Pvd. Le phénotype sauvage a été restauré par l'addition du DTT, suggérant l'implication de ses protéines dans la dissociation périplasmique de la ferri-pyoverdine par réduction du Fe3+ en Fe2+. Nous avons également montré que la protéine FpvG est une protéine périplasmique dont l'expression est régulée par les niveaux de fer. Les études de spectrométrie de masse et de dosage des métaux ont montré que cette protéine était également capable de lier directement le fer. Enfin, l'étude des interactions protéine-protéine a montré une interaction entre les protéines FpvG et FpvA, confirmant l'implication de la protéine FpvG dans le transport du fer par la Pvd. FpvG serait probablement impliquée dans la prise en charge du fer dans le périplasme après sa dissociation de la Pvd et assurant ensuite son transport vers le cytoplasme via le transporteur ABC FpvHJ. L'ensemble de ces résultats a permis également de montrer que le transport du fer via la Pvd implique des mécanismes très différents de ceux qui sont décrits précédemment pour les sidérophores utilisés par E. coli.Iron is an important component of many metabolic pathways and physiological functions. It has the property to gain or lose an electron easily, thus moving from the ferrous form (FeII) to the ferric form (FeIII) and vice versa. It is this property which gives it a role in the phenomena of biological oxidations and reductions. Although this very abundant in the earth's crust, iron is very insoluble in aerobic and at physiological pH and is thus very poorly bioavailable. The concentration of fre Fe(III) in the environment is around 10-18 M, far too low for bacterial pathogens that require a concentration of about 10-5 to 10-7 M to growth, establish and maintain infection. To circumvent the problem of low availability of iron, bacteria have developed different mechanisms to acquire this metal. The most common mechanism involves the synthesis and secretion of siderophores, with a very high affinity for Fe(III). After their secretion, siderophores chelate Fe(III) in the extracellular environment and transport it through the outer membrane via TonB dependant receptors (RTBDs). The RTBDs are also involved in the transport of other molecules such as heme. In this thesis we are interested in studying structures of various Gram-negative RTBDs and also the fath, in the periplasm, of the ferric pyoverdine, after transport across the outer membrane via FpvA home P. aeruginosa. For structural studies, we looked at 4 RTBDs (ShuA, SuxA, FauA and FetA). We have identified and optimized a protocol for overexpression, purification and crystallization of this RTBDs. The protocol used is fast, efficient and reproducible. It allowed us to purify, crystallize rapidly and collect diffraction datas for this 4 RTBDs. The structure of ShuA was then determined to 2.6 °A, that of FauA to 2.3 °A resolution by Dr. D. Cobessi. For functional studies, we investigated the involvement of genes of the cluster fpvCDEFGHJK in iron acquisition through Pvd in P. aeruginosa. This cluster is conserved in all Pseudomonas species producing Pvd, it is organized in two operons, fpvCDEF fpvGHJK, separated by 32 bps. The results obtained during this thesis suggest the involvement of proteins FpvCDEF in the periplasmic dissociation of the ferric-pyoverdine by reduction of Fe(III) to Fe(II). We also showed that the expression of periplasmic protein FpvG is regulated by iron levels. Studies of mass spectrometry and determination of metals have shown that this protein was also able to directly link iron. Finally, the study of protein-protein interactions showed an interaction between proteins FpvG and FpvA, confirming the involvement of protein FpvG in the transport of iron by Pvd. FpvG is probably involved in the management of iron in the periplasm after dissociation of Pvd and then providing transport to the cytoplasm via the ABC transporter FpvHJ. All of these results has also shown that the transport of iron via Pvd involves very different mechanisms from those described earlier for siderophores used by E. coli