Functionnal analysis of Arabidopsis thaliana's genes involved in pollen development

La paroi et le manteau du pollen des plantes supérieures se caractérisent par le haut degré de résistance qu ils confèrent au grain de pollen. Ces fonctions reposent largement sur la synthèse de composés spécifiques dérivant du métabolisme secondaire. Au cours de ma thèse, j ai caractérisé une nouvelle acyltransférase d'Arabidopsis thaliana, la Spermidine Hydroxycinnamoyl Transférase (SHT), impliquée dans la synthèse de phénolamides constitutives du manteau pollinique. Nous avons montré que SHT est spécifiquement exprimée dans les cellules du tapétum de l'anthère, et que son expression est corrélée à l'accumulation d'hydroxycinnamoyl spermidines au niveau du manteau pollinique. Nous avons démontré que la protéine recombinante catalyse in vitro ce type de composé, par le transfert d'acides hydroxycinnamiques sur les fonctions amines de la spermidine. L'analyse du mutant KO sht révèle des malformations du grain de pollen, ce qui montre l'implication du gène dans son développement. Enfin, par l'analyse de lignées silencées et par l'étude de l'activité de la protéine recombinante, nous avons identifié une CCoAOMT-like corégulée avec SHT qui intervient dans le même métabolisme, en méthylant le conjugué de spermidine in planta. Par une analyse de corégulation, nous avons sélectionné deux Polykétide Synthases (PKS-A et PKS-B) et deux Tétrakétide a-Pyrone Réductases (TPR1 et TPR2) d'Arabidopsis thaliana, fortement coexprimées avec des gènes intervenant dans la synthèse de la paroi du pollen. Une expression spécifique du tapétum a été démontrée, et l'activité enzymatique des protéines recombinantes étudiée in vitro. Les deux PKS catalysent la condensation de 2 ou 3 molécules de malonyl-CoA sur différents esters de CoA d'acide gras pour former les tri et tétrakétide a-pyrones correspondants. Nous avons montré que le tétraketide produit par les PKS, pouvait être substrat de TPR-1 et -2, qui réduisaient in vitro la fonction cétone en alcool secondaire. L'analyse des mutants KO pks-a et pks-b a permis de mettre en évidence des réductions importantes des dépôts de l'exine dans la paroi du pollen, alors que le double mutant pks-a/pks-b ne produit plus de pollen. Le mutant tpr1 est également caractérisé par une absence de pollen mature, alors que le mutant tpr2 est fertile et ne présente que de légers défauts de sa paroi pollinique. Enfin, par des analyses phylogénétiques, nous avons montré la conservation de ces gènes chez la majorité des plantes terrestres, y compris la mousse Physcomitrella, révélant ainsi l'ancienneté et la conservation de cette voie métabolique, qui conduit à la synthèse de l'sporopollénine.Pollen wall and coat are caracterized by a high degree of resistance to various stress, largely through the synthesis of secondary metabolite precursors. We caracterized the Spermidine Hydroxycinnamoyl Transferase (SHT), a new Arabidopsis BAHD acyltransferase, which is involved in the synthesis of a dihydroxyferuloyl-monosinapoyl spermidine phenolamide. We showed the specific expression of SHT in anther tapetal cells, and we investigated the in vitro activity of the recombinant protein. SHT is able to transfer an hydroxycinnamoyl moiety to each of the 3 amine fonctions of spermidine. The analysis of sht KO mutant revealed irregularities and depressions of the pollen wall, indicating the involvement of SHT gene in pollen development. Finally, a methyltransferase gene which is co-regulated with SHT during flower development, was shown to be involved in the O-methylation of spermidine conjugates by analyzing the consequences of its repression in RNAi plants and by characterizing the methylation activity of the recombinant enzyme. By in silico co-regulation analysis, we selected two Polyketide Sythases (PKS-A and PKS-B) and two Tetraketide a-pyrone Reductases (TPR1 and TPR2) tightly co-expressed with genes involved in pollen wall synthesis. The four genes were shown to be specifically expressed in tapetal cells, and the enzyme activity of each protein was determined in vitro. The two PKS recombinant proteins catalysed the condensation of 2 or 3 malonyl-CoA with various fatty acid CoA ester, producing the corresponding tri and tetraketide. The tetraketides produced by PKS were shown to be substrates of the two TPR, that reduced the cetone function to a secondary alcohol. Analysis of pks-a and pks-b KO mutants revealed severe reduction of exine deposition on their pollen wall, while pks-a/pks-b is unable to produce mature pollen. The tpr1 mutant was also male sterile while tpr2 mutant exhibited subtle changes on its pollen wall. Finally, by phylogenetic analysis, we showed the conservation of the genes involved in the biosynthesis pathway, from mosses to higher plants