Caractérisation d'un sous-complexe de TFIID et de la fonction anti-oncogène de sa sous-unité TAF4 dans les fibroblastes embryonnaires murins

L'initiation de la transcription par l'ARN polymérase II nécessite la formation d'un complexe de pré-initiation autour du site de démarrage de la transcription. Parmi les facteurs présents dans ce complexe, se trouve le complexe multi-protéique TFIID de 1,2 MDa, composé de TBP (TATA binding protein) et de 14 TAFs (TBP-associated factors). Au cours de ma thèse, j ai travaillé sur TAF4, une protéine de 135 kDa qui présente un intérêt particulier du fait de son rôle présumé dans la signalisation par l'AMPc, les récepteurs nucléaires (notamment RAR), et les stress kinases. L'étude du facteur de transcription TAF4 a d'abord été envisagée, au préalable, d'un point de vue transcriptionnel. Elle s'est enrichie d'une composante en cancérologie, dès lors que l'étude approfondie des fibroblastes embryonnaires murins (MEFs) Taf4-/- a révélé l'importance de la protéine TAF4 en tant qu anti-oncogène. Ainsi, ma thèse comporte deux parties distinctes n ayant en commun que l'importance du facteur de transcription TAF4. Afin de purifier des complexes contenant TAF4, j ai généré des lignées de MEFs exprimant un dérivé de TAF4 porteur d'une étiquette Flag. Des immunoprécipitations anti-Flag ainsi que des expériences de gel filtration et de centrifugation sur gradient de glycérol ont permis de détecter l'existence d'un sous-complexe de TFIID formé par TAF4, TAF5, TAF6, TAF9 et TAF12. Ce complexe est plus abondant que le TFIID complet dans les MEFs. En revanche, dans d'autres lignées cellulaires qui expriment des niveaux élevés de TBP, la majorité de TAF4 se trouve associée à TFIID. Nous avons donc mis en évidence l'existence d'un complexe intermédiaire d'assemblage de TFIID et montré que son abondance varie selon le type cellulaire en fonction du niveau d'expression de TBP. L'inactivation de TAF4 dans les MEFs provoque une croissance autocrine, un changement de morphologie, mais également une perte de l'inhibition de contact et une croissance cellulaire en multicouches. En injectant les MEFs Taf4-/- dans des souris nues, j ai mis en évidence leur développent rapide et leur transformation en sarcomes non différenciés, localement invasifs dans la couche musculaire sous-jacente. Le traitement des MEFs (avant injection) par l'acide rétinoïque tout-trans (AR) supprime la formation de tumeurs induites par ces cellules, mais n affecte pas leur prolifération in vitro. Nos résultats suggèrent un nouveau mécanisme de suppression de tumeur par l'AR qui modifie les propriétés de motilité et d'adhérence de ces MEFs par la régulation de plusieurs gènes impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire. A partir de l'ensemble de ces résultats, nous suggérons que l'AR exerce son effet anti-tumoral non pas au niveau de la régulation de la prolifération ou de l'apoptose, mais en agissant sur des gènes qui modifient le microenvironnement tumoral.The regulated initiation of RNA polymerase II transcription requires the formation of a multi-subunit preinitiation complex over the transcription start site. Amongst the general transcription factors in this complex, is TFIID formed by the TATA binding protein, TBP and a set of 13-14 TBP-associated factors, TAFs. I have focussed my work on TAF4, a 135 kDa protein that plays an important role in signalling by cAMP, retinoic acid, and stress kinases. This project began by considering the transcriptional properties of TAF4, but was enriched by the discovery of the anti-oncogene function of TAF4 in mouse embryonic fibroblasts (MEFs). My thesis therefore comprises two distinct aspects that have TAF4 as a common denominator. To identify protein complexes containing TAF4, I generated MEF cell lines expressing a Flag-tagged TAF4. Immunoprecipitations as well as gel filtration and glycerol gradient centrifugation demonstrated that the majority of TAF4 is present in a sub-complex together with TAF5, TAF6, TAF9 and TAF12. In MEFs, this complex is much more abundant than full TFIID, however in other cell types expressing higher levels of TBP, TAF4 is found almost uniquely in the TFIID. We have therefore identified a subcomplex that may be an assembly intermediate of TFIID and shown that its abundance varies between cell types in relation to TBP expression levels. Inactivation of TAF4 in MEFs in vitro leads to autocrine growth, morphological changes and loss of contact inhibition. By injection of the Taf4-/- MEFs in nude mice, I found that they were oncogenically transformed and capable of forming large undifferentiated and locally invasive sarcomas. TAF4 therefore has an anti-oncogene function. Treatment of the MEFs with all-trans retinoic acid (RA) prior to injection completely suppressed their ability to form tumours, but did not affect their proliferation. We rather showed that RA induces changes in the motility and adhesive properties of these cells through regulation of several genes that can remodel the extracellular matrix. Taken together, the above results show that RA does not exert its anti-tumour effect by affecting proliferation or apoptosis, but rather by a novel mecanism involving the regulation of genes that remodel the extracellular matrix and thus the tumour microenvironment