Genetic determination in grape of aromatic terpenols biosyntesis

Chez Vitis vinifera le potentiel aromatique du raisin est en partie constitué par des monoterpénols comme le linalol et le géraniol qui contribuent au caractère variétal des cépages aromatiques comme le muscat et le gewurztraminer. L'objectif de notre travail était de mettre en évidence les bases moléculaires de la spécificité des cépages aromatiques de vigne. Nous nous sommes basés sur l'hypothèse que la formation des monoterpénols était liée à une forte synthèse de géranyl diphosphate (GPP) et/ou à la métabolisation du GPP par des terpènes synthases. Ainsi, nous avons cloné les ADNc vGPPS et vFPPS codant une géranyl diphosphate synthase (vGPPS) potentielle et une farnésyl diphosphate synthase (vFPPS) de Vitis vinifera homologues à 90% et 88% aux séquences protéiques de la GPPS et de la FPPS1 d'Arabidopsis thaliana respectivement. L'expression hétérologue des ces ADNc chez Saccharomyces cerevisiae nous a permis de montrer l'activité farnésyl diphosphate synthase de la protéine vFPPS. Le produit final de réaction de vGPPS n a pu être confirmé car son activité enzymatique est extrêmement faible. Nous avons ensuite entrepris de reconstituer chez la levure les dernières étapes de la voie de biosynthèse des monoterpénols aromatiques. Ainsi, nous avons exprimé conjointement chez la levure les ADNc vGPPS et vFPPS de vigne avec les gènes codant la géraniol synthase récemment isolée chez Ocimum basilicum et la linalol synthase de Clarkia breweri toutes deux caractérisées sur le plan biochimique. Nous avons pu observer chez la levure que la formation des monoterpénols est dépendante d'une activité terpène synthase et que le substrat GPP est un facteur limitant. Les résultats obtenus montrent l'intérêt d'une approche fonctionnelle prenant en compte différentes étapes de la biosynthèse des terpènes. Il est maintenant nécessaire de conduire cette approche chez la vigne afin de mettre en évidence les spécificités métaboliques des cépages aromatiques.The floral character of aromatic varieties of Vitis vinifera is partly linked to the presence in the berry skin of monoterpenic alcohols such as geraniol and linalool found in large amounts. Non aromatic grapevine varieties, in contrast, exhibit much lower terpenoid concentrations. Combining genetic, biochemical and molecular approaches, we tried to decipher the metabolic pathway which leads to monoterpenic alcohols synthesis in aromatic grapevine varieties. It is commonly admitted that monoterpenoids arise from geranyl diphosphate (GPP). So we hypothesized that the high yield of monoterpenoids synthesized in aromatic plants requires either an excess of GPP synthesis and/or a specific metabolization of GPP by terpene synthases (TPS). We isolated vGPPS and vFPPS cDNAs encoding putative geranyl diphosphate synthase and farnesyl diphosphate synthase from Vitis vinifera gewurztraminer, muscat and savagnin rose varieties. Both vGPPS and vFPPS from grapevine share 90% and 88% homology with the corresponding enzymes from Arabidopsis thaliana. A functional analysis in yeast Saccharomyces cerevisiae using adapted mutants strains led us to demonstrate the farnesyl diphosphate activity of vFPPS. In contrast, this approach failed to reveal the end product of vGPPS. To determine the effect of vGPPS and vFPPS on the terpenoid biosynthesis pathway, we expressed in yeast these two cDNAs in combination with the Ocimum basilicum geraniol synthase and the Clarkia breweri linalool synthase. Under these experimental conditions, we showed that GPP amount is an important factor of the pathway together with terpene synthases which are the basic actors. Altogether, our data suggest that the functional analysis approach in yeast was an adequate system to help us for deciphering the first basic steps of the grapevine terpenoid biosynthesis pathway. This approach must now be conducted in grape to clarify differences between aromatic and non aromatic grapevine genotypes