Contribution à l'étude de l'ARN polymérase II de Plasmodium falciparum

L'ARN polymérase II de Plasmodium falciparum, parasite responsable de la forme la plus grave du paludisme, catalyse la transcription des gènes codant les protéines. Nous avons identifié, dans le génome de cet eucaryote apicomplexe, des séquences codant potentiellement les douze sous-unités de l'enzyme parasitaire. Ces séquences ont été clonées par reconstitution génique. Nous avons caractérisé génétiquement l'ARN polymérase II de Plasmodium falciparum en réalisant des tests de complémentation fonctionnelle des sous-unités de ce complexe enzymatique. Nos résultats indiquent que les sous-unités PfRPB4-5-7-9 et 12 codent des protéines capables de remplacer leurs homologues chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces sous-unités sont bien des orthologues des protéines de levure. De fait, nous avons construit des lignées de levures exprimant de façon stable des protéines de Plasmodium falciparum. Par ailleurs, Les sous-unités PfRPB3-6-8-10 et 11 ne complémentent pas. Nous avons construit des souches viables de levures dont le site de fixation de l'alpha-amanitine sur leur ARN polymérase II est plasmodifié ou humanisé . Un crible de chimiothèque réalisé à l'aide de ces levures ne nous a pas permis d'identifier des molécules capables d'inhiber sélectivement les levures plasmodifiées . Cependant nous avons mis au point un test cellulaire simple et dont la mise en oeuvre est aisée et permettra l'identification de molécules capables de bloquer l'activité transcriptionnelle de l'enzyme du parasite. De telles drogues constitueront le point de départ vers la mise au point d'une nouvelle classe d'antipaludiques. Enfin, des expériences de double hybride chez la levure ont permis de montrer que la sous-unité hRPB11a de l'ARN polymérase II humaine, contrairement à son homologue de levure, est capable former un homodimère. Ceci est confirmé par des profils de diffraction, à une résolution de 3,4 °A, de cristaux de hRPB11. Ces derniers résultats constituent une contribution importante aux efforts de la communauté scientifique pour l'élucidation de la structure tridimensionnelle de l'ARN polymérase II humaine.The parasite Plasmodium falciparum is the causative agent of the most burdensome form of human malaria. His RNA polymerase II (RNAPII) is responsible for transcription of protein coding genes. The sequencing of the full genome of the parasite enabled us to recover a complete set of genes sequences encoding the putative RNAPII subunits of the parasite. We have cloned those subunits by genetic reconstitution. We investigated the functional conservation of the Plasmodium RNAPII subunits using a genetic test in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The subunits PfRPB4-5-7-9 and 12 can complement defective yeast mutants. Those results demonstrate that those subunits are orthologs of yeast conterparts. We establish then some stable yeast strains expressing Plasmodium proteins. No interspecific complementation was observed for the subunits PfRPB3-6-8-10-11. We construct viable yeast strain where the residus implicated in the interaction of the mushrom toxin alpha-amanitin where substituted by their homologs in Plasmodium and human. We screen those strains with a chemical compounds library. We don t find any drug enable to distinguish the modified strains from wild-type one. But this screen, consisting in a simple cellular test and easy to perform, could permit to identify drugs that inhibit the transcriptional activity of the parasite enzyme. Those chemical compounds will the fist step towards the discovery of a potential new class of antimalarials drugs. In this work, we also study the human RNA polymerase II (RNAPII) hRPB11a subunit. we performed an interaction analysis using the two hybrid-system in yeast. The results confirmed that hRPB11a was indeed capable of interacting with itself. We were able to crystallise the purified hRPB11a subunit. The X-ray diffraction patterns at 3,4 °A resolution allows to infer the structure of an homodimer of the hRPB11a protein