Efecto de la vacunación frente a la paratuberculosis caprina sobre la respuesta inmunitaria y la patogenia de la enfermedad = Effect of vaccination against paratuberculosis on the immune response and pathogenesis of the disease in goats

337 p.La paratuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa de carácter crónico que está causada por Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map). Está difundida por todo el mundo y causa importantes pérdidas económicas en la industria ganadera. Para su control, la única medida que se ha demostrado útil en términos coste-beneficio, es la vacunación. Sin embargo, posee una serie de desventajas, como es el hecho de que produce reacciones cruzadas con las pruebas de diagnóstico empleadas en las campañas de erradicación de la tuberculosis, o que la protección no es completa, ya que, aunque reduce la aparición de casos clínicos y la excreción de Map, esto no se consigue en todos los casos. Por otra parte, además de un efecto protector, hay evidencias en estudios de campo que sugieren que la vacunación podría tener un efecto terapéutico, que hasta el momento no se ha logrado demostrar. Existen, por lo tanto, muchas incógnitas sobre cuáles son los efectos de la vacunación, y ciertos aspectos relacionados con ella, sobre la patogenia de la paratuberculosis y la respuesta inmunitaria de los animales. Su esclarecimiento es el objetivo general de esta Tesis Doctoral. Para ello, se han desarrollado tres estudios, que además van a responder a varios objetivos de carácter más específico. El primer estudio tiene como objetivo evaluar el efecto de la vacunación, en función de la edad de los animales, sobre la respuesta inmunitaria y el control de la enfermedad, en una explotación caprina comercial con casos clínicos de la enfermedad. Para su logro, se planteó un estudio en un rebaño de cabras murciano-granadina, de producción lechera, donde se inmunizaron, con la vacuna inactivada Gudair®, cabras a tres edades diferentes: 39 cabras adultas (mayores de 1,5 años), dejándose 38 animales de la misma edad sin vacunar; 40 cabritas de 5 meses de edad, con otras 39 de edad similar como controles, y 19 animales de 1,5 meses y otras 15 sin vacunar. En todos los animales se tomaron muestras de sangre con periodicidad trimestral, hasta los 21 meses post-vacunación (mpv) para valorar la producción de IFN-γ mediante la técnica IGRA, empleando las PPD aviar y bovina, y los niveles de anticuerpos séricos empleando un ELISA indirecto. A los 6 y a los 18 mpv, se llevó a cabo la prueba de IDTB simple y comparada. También se controló el número de bajas, por cualquier razón, durante 21 meses, tanto en los grupos vacunados como no vacunados. En todos los grupos vacunados se observó un incremento significativo en la producción de IFN-γ, cuando se estimularon las muestras de sangre con PPD aviar desde los 3 mpv hasta los 18 mpv y con PPD bovina, entre los 3 y 21 mpv. Igualmente, también hubo un incremento significativo de los niveles de anticuerpos séricos entre los 3 y 21 mpv, en todos los grupos vacunados. También, se observaron diferencias según la edad de vacunación de forma que los niveles más elevados se encontraron en los animales vacunados a los 5 meses, y los menores en los individuos adultos. No se encontraron reaccionantes positivos a tuberculosis en las dos IDTB realizadas. Tampoco se detectaron bajas asociadas a paratuberculosis en ninguno de los grupos. Sin embargo, cuando se analizó el número de bajas totales, independientemente de su causa, se observó que era significativamente menor en los grupos vacunados (6,12 %) que en los no vacunados (14,13 %). Esto era especialmente evidente en el grupo de cabritos inimunizados con 1,5 meses, donde no ocurrió ninguna baja, mientras que en el grupo no vacunado mnurieron 3 animales durante el primer año por procesos neumónicos. Estos resultados sugieren que la vacunación de paratuberculosis, especialmente en animales jóvenes, induce una protección heteróloga frente a otros procesos infecto-contagiosos. El segundo estudio se planteó con el objetivo de valorar el efecto de la vacunación, previa o posterior a una infección experimental con Map, sobre la patogenia de la paratuberculosis, valorando el desarrollo de lesiones, la respuesta inmunitaria periférica y local o la colonización de Map en tejidos y heces. Se emplearon 35 cabritos de 1,5 meses de edad, que fueron separados en 6 grupos experimentales. Un grupo de 8 cabritos (VI) fue vacunado 30 días antes de que se les produjera el desafío oral con la micobacteria; 4 cabritos (VNI) permanecieron como animales control de esa vacunación; 9 cabritos fueron desafiados, pero no vacunados (NVI); 5 cabritos fueron desafiados y 150 días después fueron vacunados (IV); 2 cabritos permanecieron como controles de esa vacunación a los 150 dpi (NIV) y, por último, 7 cabritos permanecieron como animales sin vacunar ni infectar (NVNI). La inmunización se llevó a cabo con la vacuna inactivada Silirum® y para el desafío se empleó la cepa de referencia K-10 de Map. Se tomaron muestras de sangre con periodicidad mensual, entre los 0 y 360 días post-vacunación (dpv), para evaluar la respuesta inmunitaria periférica celular y humoral, con las mismas técnicas del primer estudio, y a los 120 dpv (90 dpi) se realizó la prueba de IDTB comparada, empleando PPD aviar y bovina. A los 120 días post-infección (dpi) y a los 330 dpi se llevaron a cabo sacrificios para evaluar el efecto de la vacunación sobre el desarrollo de las lesiones, la respuesta inmunitaria local y la presencia de micobacterias en tejidos. Durante la duración del estudio, se pudo comprobar cómo se producía un incremento significativo en la producción de IFN-γ tras la estimulación de la sangre con PPD aviar al mes de producirse la vacunación en los grupos vacunados a los -30 dpi, mientras que fue más tardía (60 dpv) en el caso de los grupos vacunados a los 150 dpi. Este incremento fue mucho más prolongado en el caso de la vacunación a los -30 dpi (6 mpv) que en el caso de la vacunación a los 150 dpi (3 mpv). Asimismo, se observó un patrón similar en la PPD bovina, donde se vieron incrementos significativos similares a los observados en el caso de la PPD aviar, aunque siempre inferiores. La posible interferencia de la vacunación en el diagnóstico de la tuberculosis, no se observó al hacer la IDTB comparada, pero si con la IDTB simple, ya que un 58,3 % de los cabritos vacunados fueron positivos. En ambos grupos vacunados, se detectaron niveles de anticuerpos significativamente más elevados, a los 60 dpv, que se mantuvieron durante 7 meses, en el caso del grupo VI y 3 meses en el grupo IV. Sin embargo, la vacunación no modificó los porcentajes de las poblaciones de linfocitos T CD4+, T CD8+, T δγ o B en sangre circulante, valorados mediante citometría de flujo. Se pudo comprobar que la vacunación no evitó la infección por Map de los animales, ya que en todos los grupos se pudieron identificar lesiones, así como ácidos nucleicos de esta micobacteria mediante PCR. Sin embargo, sí se pudo observar como la vacunación consiguió un efecto protector sobre los cabritos del grupo VI, ya que solo mostraron lesiones restringidas al tejido linfoide (de tipo focal o multifocal a) y, mediante el recuento del número de granulomas, se demostró que disminuyeron con el tiempo. Es de destacar que, a diferencia de los cabritos del grupo NVI, los granulomas del tejido linfoide mostraban un carácter regresivo, con un incremento en la cantidad de tejido conjuntivo. Sin embargo, no se pudo demostrar con claridad el posible efecto terapéutico de la vacunación, ya que se observó una gran variabilidad individual en las respuestas de los animales del grupo IV, con cabritos sin lesiones o lesiones focales, hasta un animal con una lesión difusa y gran cantidad de bacilos en el intestino, a pesar de mostrar una respuesta inmunitaria celular muy elevada y del que se consiguió aislar Map mediante el cultivo de sus tejidos. La existencia de este animal plantea la posibilidad de que la vacunación tras la infección pudiera exacerbar esta última en algunos animales. En cuanto a la respuesta inmunitaria local, la vacunación no indujo cambios en las subpoblaciones linfocitarias presentes en el tejido linfoide intestinal, nódulos linfáticos yeyunales o nódulo linfático preescapular. Sólo en esta última localización se detectaron niveles más elevados de IFN-γ tras la estimulación con PPD aviar de los linfocitos purificados a los 360 dpv en animales vacunados. Lo que no se observó en el resto de muestras estudiadas. El tercer objetivo de este trabajo de investigación fue analizar la respuesta inmunitaria celular mediante la técnica IGRA, desarrollada por animales sensibilizados frente Map cuando eran expuestos a nuevos antígenos específicos de M. bovis y Map. Para ello, se desarrolló un tercer ensayo, empleando animales del primer y segundo estudio, en muestreos realizados a diferentes días post-vacunación, empleando como antígenos para estimular la sangre la PPD aviar y bovina, la johnina, dos cócteles peptídicos (PC-EC y PC-HP) de M. bovis y los antígenos VK 055 y VK 067 de Map. No se observó producción específica de IFN-γ tras la estimulación de la sangre con los dos cócteles de M. bovis en ningún animal vacunado ni en ningún muestreo, mientras que sí se obtuvo cuando se empleó la PPD bovina, lo que apoya su posible uso en las campañas de erradicación de la tuberculosis al mejorar la especificidad de la PPD bovina. En cambio, los dos antígenos de Map probados en este estudio no mejoraron la sensibilidad de la johnina ni la PPD aviar en la detección de cabritos vacunados oinfectados por Map