Optimización de las técnicas de evaluación y vitrificación de ovocitos de équidos

Equine oocyte cryopreservation is an assisted reproductive technology that allows to preserve female genetic material from valuable mares. The main objective of this thesis was to optimize the evaluation and vitrification of equine oocyte. In chapter 1, two concentrations of the fluorochrome Hoechst 33342 (HO) were compared to assess the nuclear chromatin stage of the oocyte after vitrification using nonpermeable and permeable cryoprotectant agents (CPAs). A higher percentage of oocytes showing upper visibility grade was found when using a lower concentration of fluorescent labels. The assessment of a vitrification solution free of permeable CPAs was performed for the first time in equine oocytes. Unfortunately, no cryoprotectant-free-vitrified oocytes reached metaphase II after warming, therefore cryoprotectant-free vitrification cannot be considered an alternative to conventional equine oocyte vitrification. Chapter 2 was designed to evaluate the DNA fragmentation of equine granulosa cells (GCs) as a biomarker to evaluate the developmental competence of the equine oocyte after cryopreservation. The use of cryopreservation protocols combining different storage temperatures (-80ºC/-196ºC) and CPAs (ethylene glycol or dimethyl sulfoxide), adequately preserved the DNA of equine GCs. The chromatin dispersion test was found as a reliable method to assess DNA fragmentation in equine GCs. The percentage of GCs-DNA fragmentation was higher in GCs from oocytes able to mature. In chapter 3, the effect of permeable cryoprotectant-free vitrification was evaluated on DNA fragmentation of equine cumulus cells. Low and total fragmentation rates of vitrified equine cumulus cells were higher when compared to control group. The use of sucrose as CPA increase the total DNA fragmentation rates of equine cumulus cells but protected them against high DNA fragmentation rates during equine oocyte vitrification. In conclusion, according to the results obtained in this Doctoral Thesis; a low concentration of Hoechst 33342 is recommended to assess the nuclear chromatin stage of equine oocytes; DNA fragmentation analysis of equine granulosa cells can be a valuable test to identify equine oocytes showing the best meiotic competence after in vitro maturation; and cryoprotectant-free vitrification cannot be considered an alternative to conventional vitrification solution for equine oocytes.La criopreservación de ovocitos equinos es una técnica de Reproducción Asistida que permite preservar el material genérico de yeguas valiosas. El objetivo de la presente tesis fue optimizar las técnicas de evaluación y vitrificación de ovocitos equinos. En el capítulo 1, se compararon dos concentraciones del fluorocromo Hoechst 33342 (HO) para evaluar el estado de la cromatina nuclear del ovocito tras la vitrificación usando agentes crioprotectores (CPAs) permeables y no permeables. Empleando menores concentraciones de sustancias fluorescentes, se obtuvo un mayor porcentaje de ovocitos mostrando mayor grado de visibilidad. Medios de vitrificación sin CPAs permeables se han empleado por primera vez en ovocitos equinos. Desafortunadamente, ningún ovocito consiguió alcanzar el estado de metafase II tras el calentamiento en ausencia de crioprotectores permeables, por lo que la vitrificación sin CPAs permeables no puede ser considerada una alternativa a la vitrificación convencional de ovocitos. El capítulo 2 fue diseñado para evaluar la fragmentación del ADN de las células de la granulosa (GCs) como biomarcador para el desarrollo de competencia de los ovocitos de équidos tras la crioconservación. El uso de cualquier protocolo de crioconservación combinando diferentes temperaturas (-80ºC/-196ºC) y CPAs (etilenglicol y dimetilsulfóxido) preservó adecuadamente el ADN de las GCs de équidos. El test de la dispersión de la cromatina resultó en una técnica válida para evaluar el ADN de las GCs de ovocitos equinos. Los ovocitos que consiguieron madurar mostraron mayor fragmentación del ADN de las GCs. En el capítulo 3, se evaluó el efecto de la vitrificación en ausencia de CPAs permeables sobre la fragmentación del ADN de las células del cúmulo de ovocitos equinos. La tasa de fragmentación baja y total de las células del cúmulo del ovocito equino fue mayor cuando se comparó con el grupo control. El uso de medios de vitrificación compuestos por sacarosa como único CPA, aumenta la tasa de fragmentación total del ADN de las células del cúmulo, pero las protege frente a la alta tasa de fragmentación del ADN durante la vitrificación de ovocitos equinos. En conclusión, de acuerdo a los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral; una concentración baja de fluorocromo Hoechst 33342 es recomendada para evaluar el estado nuclear de la cromatina de ovocitos equinos; el análisis de la fragmentación del ADN de las células de la granulosa de équidos puede ser un método valioso para identificar ovocitos equinos mostrando la mejor competencia meiótica tras ser madurados in vitro; la vitrificación sin agentes crioprotectores permeables no puede ser considerada una alternativa a la vitrificación convencional