Effect of caloric restriction on mineral metabolism and kidney disease

La ingesta calórica interviene en la regulación del metabolismo mineral a diferentes niveles, principalmente renal, cardiovascular, óseo y muscular. La ingesta calórica influye en el desarrollo y la progresión de la enfermedad renal, de forma que el consumo de dietas con alto contenido en grasas favorece el deterioro de los riñones incluso en ausencia de obesidad. Por su parte, la restricción calórica (RC) tiene múltiples efectos beneficiosos sobre la salud y la longevidad y ha demostrado ser un elemento útil para preservar la funcionalidad renal. La presente Tesis Doctoral persigue investigar la influencia de la RC sobre el metabolismo mineral poniendo el foco en los aspectos de mayor interés en el contexto de la enfermedad renal crónica: el manejo del fósforo, la síntesis y secreción de factor de crecimiento de fibroblástico 23 (FGF23) y de calcitriol, y el desarrollo de calcificación vascular (CV). Por otra parte, la influencia de la RC en el músculo es controvertida y los mecanismos están aún por elucidar. Es por ello que en este trabajo se ha abordado el estudio de los efectos de la RC sobre el fenotipo del músculo esquelético, así como la implicación de la vitamina D sobre los cambios en la masa muscular y la composición fibrilar. Para probar la hipótesis de que el FGF23 está directamente regulado por la ingesta calórica, se llevaron a cabo experimentos in vivo e in vitro. En los experimentos in vivo se estudió la influencia de la ingesta calórica sobre el metabolismo del fósforo y la producción de FGF23 en dos escenarios de RC, mediante la modificación del contenido calórico de la dieta o a través de la restricción de la ingesta total de alimento. En el primer estudio tres grupos de ratas fueron alimentados con dietas con un contenido calórico alto (HC), normal (NC) o bajo (hC) durante 30 días. No se observaron diferencias en la absorción intestinal ni en las concentraciones plasmáticas de fósforo entre los tres grupos de ratas. Las concentraciones plasmáticas de FGF23 se incrementaron en el grupo HC y disminuyeron en el grupo hC, en comparación con las ratas del grupo NC. Además, los niveles de FGF23 correlacionaron positivamente con la ingesta calórica de los animales. En el segundo estudio, se incluyeron dos grupos de ratas alimentadas con una dieta normocalórica sometidas a un régimen de ingesta ad libitum (control) o restringida (NCR). Tras un periodo de 50 días, las ratas NCR presentaron un balance de fósforo negativo, una menor concentración plasmática de fósforo y una disminución de los niveles plasmáticos de FGF23, en comparación con el grupo control. In vitro, se incubaron células osteogénicas UMR106 en un medio de cultivo con un contenido de glucosa alto (HG, 4,5 g/l) o bajo (LG, 1 g/l). Además, se llevaron a cabo estudios adicionales incluyendo tratamientos con diferentes concentraciones de fósforo, estudios de osmolaridad con manitol y estudios mecanicistas mediante con la exposición a inhibidores de la vía mTOR, como rapamicina o everolimus. La expresión de ARN mensajero (ARNm) de FGF23 fue significativamente mayor en células UMR106 cultivadas en HG que aquellas incubadas con LG. Cuando se expusieron las células a una concentración elevada de fósforo, el ARNm de FGF23 aumentó, aunque este efecto sólo se observó cuando las células se cultivaron en HG. La incubación de células en medio HG y con inhibidores mTOR disminuyó la expresión de ARNm de FGF23 respecto a aquellas incubadas sólo con el vehículo. Estos valores fueron similares a los obtenidos con la incubación en un medio LG. En conclusión, estos estudios ponen de manifiesto la existencia de una regulación directa de la producción de FGF23 por la disponibilidad de energética y demuestran que la vía de señalización mTOR juega un papel central en este sistema regulador. En un tercer estudio se investigó el efecto de la RC sobre el desarrollo y regresión de la CV en ratas urémicas. Para ello se incluyeron cuatro grupos de ratas las cuales se distribuyeron en función de si tuvieron una pauta de alimentación con ingesta calórica normal o restringida. El contenido de fósforo de las dietas se ajustó para proporcionar una ingesta de fósforo igual en todos los grupos independientemente de la ingesta calórica. Tras un periodo de 50 días, a todos los animales se les indujo uremia mediante nefrectomía (Nx) 5/6. Tras la Nx, las ratas fueron tratadas con calcitriol (80 ng/kg ip en días alternos) y alimentadas con una dieta con un contenido de fósforo del 1.2% (NC1,2) o 1.8% (NC1,8) para inducir el desarrollo de CV. Después de 14 días de tratamiento, no se observaron diferencias significativas en el contenido de calcio aórtico entre ratas que tuvieron una ingesta calórica normal y aquellas sometidas a RC durante el periodo previo a la Nx, ni en los grupos NC1,2 ni en los grupos NC1,8. Sin embargo, la mortalidad aumentó significativamente en las ratas sometidas a RC antes de la Nx tanto en el grupo NC1,2 como en el grupo NC1,8. Después del periodo de CV un grupo de ratas fue sometido a un protocolo de regresión de CV, en el que se detuvo la administración de calcitriol y se normalizó la ingesta de fósforo, distribuyendo los animales en dos grupos, con ingesta calórica normal o reducida. La CV regresó rápidamente, pero no se observaron diferencias significativas en el calcio aórtico entre las ratas que tuvieron una ingesta calórica normal o restringida. En conclusión, la RC no previno ni mejoró la CV e incrementó la mortalidad en ratas urémicas. Finalmente, para abordar el estudio de los efectos de la RC sobre el fenotipo muscular, 34 ratas fueron alimentadas con una dieta de contenido calórico normal (control) o reducido (hC) durante un periodo de 7 meses. Se estudió el efecto sobre la masa muscular, el índice somático muscular (ISM), la composición del tipo de fibra, el tamaño de la fibra y la actividad metabólica en los músculos tibial craneal (TC) y sóleo (SOL). Además, se midieron los metabolitos plasmáticos de la vitamina D y la expresión renal de enzimas implicadas en el metabolismo de la vitamina D con el fin de aclarar la implicación de la vitamina D los cambios del fenotipo muscular. En el grupo hC, no se observó cambio en el tamaño muscular del TC aunque sí se encontró una reducción en el SOL; sin embargo, el ISM aumentó en ambos músculos. Los estudios histomorfométricos mostraron un incremento en el porcentaje de fibras de tipo IIA y una reducción en la proporción de fibras de tipo IIX en el TC de ratas con dieta hC. Además, se identificó una disminución del tamaño de las fibras de tipo I y una reducción de la actividad oxidativa en el sóleo de estas ratas en comparación con el grupo control. Las ratas hC presentaron un incremento significativo en los niveles plasmáticos de calcitriol, acompañado de un aumento en la expresión renal de Cyp27b1 y una disminución de Cyp24a1. Se observó una fuerte correlación positiva entre la concentración de calcitriol y el ISM en ambos músculos. El calcitriol también correlacionó significativamente con los porcentajes de fibras tipo IIA y tipo IIX en TC y con el perfil oxidativo en SOL. En conclusión, la RC preserva la masa del músculo esquelético, mejora el fenotipo contráctil en los músculos fásicos (TC) y reduce el gasto energético en los músculos posturales (SOL), beneficios que están estrechamente relacionados con el incremento de vitamina D secundario a la RC.Caloric intake influences the regulation of mineral metabolism at different levels, mainly renal, cardiovascular and musculoskeletal. Caloric intake is involved in the development and progressions of kidney disease so that the consumption of high-fat diets favors the deterioration of kidneys even in the absence of obesity. Caloric restriction (CR) is known to have multiple beneficial effects on health and longevity and has been shown to be a useful tool to preserve renal function. This Doctoral Thesis seeks to investigate the influence of CR on mineral metabolism focussing on the aspects of major interest in the context of chronic kidney disease: phosphate handling, synthesis and secretion of fibroblast growth factor 23 (FGF23) and calcitriol, and the development of vascular calcification (VC). On the other hand, the influence of CR on muscle is controversial and the mechanisms need to be elucidated. That is why this work has approached the study of the effects of CR on the skeletal muscle phenotype, as well as the role of vitamin D on changes in muscle mass and fiber-type composition. To test the hypothesis that FGF23 is directly regulated by energy intake, in vivo and in vitro experiments were conducted. In in vivo experiments, the influence of energy intake on phosphate metabolism and FGF23 production was studied in two scenarios of CR, by modifying the caloric content of the diet or by deprivation of food consumption. In the first study, three groups of rats were fed diets with high (HC), normal (NC), and low (LC) caloric content for 30 days. We did not find differences in intestinal absorption between the three groups of rats. Plasma FGF23 concentrations were increased in the HC group and decreased in the LC group, as compared with NC. Moreover, a significant correlation between energy intake and plasma FGF23 concentrations was observed. In the second study, two groups of rats fed a normocaloric diet were included and subjected to an ad libitum (control) o restricted (NCR) feeding regime. After 50 days, NCR rats showed a negative phosphorous balance, less concentration in plasma phosphorus, and a decrease of plasma FGF23 levels, compared to the control group. In vitro, UMR106 cells were incubated in a high (HG, 4.5 g/l) or low glucose (LG, 1 g/l) medium. Additional experiments were conducted including treatments with different concentrations of phosphorus, osmolarity studies with mannitol, and mechanistic experiments by exposure to mTOR inhibitors, such as rapamycin or everolimus. mRNA FGF23 was significantly higher in UMR106 cells cultured in HG than in LG. When UMR106 cells were exposed to high phosphorous, mRNA FGF23 increased but only when cells were cultured in HG. Cells incubated with HG and mTOR inhibitors decreased mRNA FGF23 expression, compared to those incubated with the vehicle. These values were similar to the data obtained in cells incubated in LG. In conclusion, these studies evidence a direct regulation of FGF23 production by energy availability and demonstrate that the mTOR signaling pathway plays a central role in this regulatory system. The third study investigated the effect of CR on the development of VC in uremic rats. Four groups of rats were included and allocated according to a feeding regime with normal or restricted caloric intake. Phosphorus content of the diets was adjusted so phosphorus intake was similar in all groups, despite the caloric intake. After 50 days, uremia was induced by 5/6 nephrectomy (Nx) in all animals. After Nx, rats were treated with calcitriol (80 ng/kg ip every other day) and high phosphorus diets with a content of 1.2% (NC1.2) or 1.8% (NC1.8) to induce VC. After 14 days of treatment, no differences were found in aortic calcium content between rats that ate normal or restricted calories before Nx in either NC1.2 or NC1.8 rats. However, mortality was significantly increased in both CR groups, NC1.2 and NC1.8. After the period of VC, rats were subjected to regression of VC when calcitriol was stopped and phosphorous intake normalized, and animals were allocated in two groups, normal and restricted calories. VC regressed rapidly, but no significant differences in aortic calcium were observed between rats that ate normal or restricted calories during the regression phase. In conclusion, CR did not prevent or ameliorate VC and increased mortality in uremic rats. Finally, to test the effect of CR on muscle phenotype, 34 rats were fed either a diet with a normal (control) or reduced (hC) caloric content for 7 months. Muscle mass, muscle-somatic index (MSI), fiber-type composition, fiber size, and metabolic activity were studied in both tibial cranial (TC) and soleus (SOL) muscles. Moreover, plasma vitamin D and renal expression of enzymes involved in vitamin D metabolism were measured to investigate the role of vitamin D in muscle phenotype changes. In the hC group, no change in muscle size was found in TC but a reduction in SOL was observed; however, MSI increased in both muscles. Histomorphometric studies showed an increase in type IIA fibers percentage and a decreased in type IIX fibers in TC of hC rats. Moreover, decreased size of type I fibers and reduced oxidative activity were identified in SOL of hC rats, compared to control. An increase in plasma calcitriol with kidney up‐regulation of Cyp27b1 and down‐regulation of Cyp24a1 was observed in hC rats. A strong correlation between plasma calcitriol concentration and MSI was observed in both muscles. Calcitriol also correlated with the percentages of type IIA and type IIX fibers in TC and with the oxidative profile in SOL. In conclusion, CR preserves skeletal muscle mass, improves contractile phenotype in phasic muscles (TC), and reduces energy expenditure in antigravity muscles (SOL), benefits that are closely related to the increases in vitamin D secondary to CR