Testing miRNA-cell based strategies to obtain therapeutic secretomes for spinal ALS

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease characterized by the loss of upper and lower motor neurons (MNs) and glia dysfunction, which con-tribute to disease onset and progression. miRNA dysregulation and neuroinflammation have been pointed to contribute for MN degeneration in ALS. Lately, our group demon-strated that miR-124 was increased in SOD1G93A (mSOD1) NSC-34 MNs and in their de-rived sEVs, causing an early microglia activation followed by cell repairing mechanisms. Increased expression of miR-124 was also identified in the spinal cord (SC) of mSOD1 mice during the symptomatic stage, indicating a potential pathological role of this miRNA in ALS. Interestingly, the secretome from mSOD1 MNs transfected with anti-miR-124 was promising in reverting the damage-associated mechanisms since it prevents neurodegeneration, microglia activation and the pathology associated to neuro-immune homeostatic imbalance in spinal cord organotypic cultures (SCOCs) from mSOD1 mice. Moreover, unpublished studies from our group have shown increased levels of miR-125b in micro-glia isolated from the SC of mSOD1 mouse pups and cultured for 16 days in vitro (aged cells). miR-125b was also found increased in mSOD1 NSC-34 MNs, while it was shown to be upregulated in the SC of symptomatic/end-stage mSOD1 mice and to drive microglia activation and MN death in ALS. Here, our major goal was to explore the potential therapeutic effects of secretomes from MNs and microglia after reparative strategies with anti-miR-124 and anti-miR-125b towards translation into clinics. Our results highlight that secretome from mSOD1 MNs with normalized levels of miR-124 and miR-125b counter-acted some abnormalities found in the mSOD1 SCOCs such as axonal transport, phagocytic ability and oligodendrocytes maturation. Our data also suggest that the combined usage of anti-miR-124 and anti-miR-125b modulatory strategies may provide a better therapeutic approach to be adopted. Further, although both secretomes from either modulated mSOD1 MNs or mSOD1 microglia are able to restore cellular homeostasis in mSOD1 SCOCs, our findings suggest that modulated mSOD1 MNs secretome produces more benefits in comparison with those from modulated mSOD1 microglia in ALS, for early stages of disease progression.A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa caracteri-zada pela perda de neurónios motores (NMs), superiores e inferiores, e pela disfunção da glia, que contribuem para o início e progressão da doença. A desregulação de miRNAs e a neuroinflamação têm sido apontados como fatores que contribuem para a degeneração dos NMs na ELA. Recentemente, o nosso grupo encontrou níveis aumentados de miR-124 em NMs SOD1G93A (mSOD1) NSC-34 e em pequenas vesículas extracelulares libertadas por estes NMs mutados, o que resultou numa ativação precoce da microglia, seguida de mecanismos de reparação celular. O aumento da expressão de miR-124 também foi identificado na medula espinhal de ratinhos mSOD1 durante a fase sintomática da doença, indicando um potencial papel patológico deste miR-124 na ELA. Curiosamente, o secretoma de NMs mSOD1 transfectados com anti-miR-124 demonstrou ser promissor na reversão de mecanismos danosos, uma vez que preveniu a neurodegeneração, ativação da microglia e o desequilíbrio neuroimune associado à patologia, em culturas organotípicas de medula espinhal de ratinhos mSOD1. Para além disso, estudos não publicados do nosso grupo mostraram níveis aumentados de miR-125b em microglia isolada da medula espinhal de ratinhos recém-nascidos mSOD1 e em microglia em cultura por 16 dias in vitro (células envelhecidas). miR-125b também foi encontrado aumentado em NMs mSOD1 NSC-34 (dados não publicados) e na medula espinhal de ratinhos mSOD1 sintomáticos/em fase final, o que conduziu à ativação microglial e à morte de NMs na ELA. Neste trabalho, o principal objetivo foi explorar os potenciais efeitos terapêuticos dos secretomas de NMs mSOD1 e de microglia mSOD1 após a aplicação de estratégias reparativas com anti-miR-124 e anti-miR-125b, usando culturas organotípicas (COs) de medula espinhal de ratinho, de modo à aplicação futura da terapia num contexto clínico. Os nossos resultados realçam que o secretoma de NMs mSOD1 com níveis normalizados de miR-124 ou miR-125b tem a capacidade de neutralizar algumas anomalias encontradas em mSOD1 de COs de medula espinhal, como o transporte axonal, capacidade fagocítica e maturação de oligodendrócitos. Os nossos dados revelam também que o uso combinado de ambas as estratégias modulatórias, de anti-miR-124 e anti-miR-125b, pode corresponder à melhor abordagem terapêutica a ser adotada. Por outro lado, embora ambos os secretomas de NMs mSOD1 e microglia mSOD1 sejam capazes de restaurar a homeostase celular em mSOD1 de COs de medula espinhal, os nossos resultados sugerem que o secretoma de NMs mSOD1 modula-dos parece produzir mais efeitos benéficos em comparação com os produzidos pelo secretoma de microglia mSOD1 modulada em ALS, nesta fase inicial da progressão da doença