Artificial scaffolds for affinity-triggered bioseparations

Monoclonal antibodies (mAb) are, to this date, the dominant class of biologicals developed by the biopharmaceutical industry. A new trend of growing diversification of other antibody molecular formats is arising with the development of antigen-binding fragments (Fab) and other derived fragments. Despite this growing repertoire of antibodies, the downstream strategies have remained stalled throughout decades, only addressing purification of full-length antibodies. This thesis focused on the development of novel affinity ligands for the purification of not only full-length antibodies, but also of Fab and non-human antibodies. By taking inspiration on a rationally designed Petasis-Ugi library, a synthetic approach was evaluated. The library was screened towards binding of polyclonal human immunoglobulin G (IgG), wherein B1Al2A2 was selected as lead candidate. The broad specificity of B1Al2A2 enabled a purification platform-like behaviour for the isolation of IgG, Fab, Nanobody and immunoglobulin Y, from complex mixtures achieving high purities and yields under mild elution conditions. A different strategy employing biological combinatorial libraries displaying an artificial protein domain scaffold was also tested. The phage pool was screened towards IgG, revealing E6 as a high-affinity binder. E6 was recombinantly expressed in Escherichia coli, purified and exhibited a 154nM affinity for IgG, as determined by Microscale Thermophoresis (MST). Encouraged by these results, the library was screened to select a ligand for Fab. A biopanning depletion scheme was designed to minimize the existence of non-specific binders by inclusion of negative selection steps with closely related impurities to Fab. Computational docking studies were performed to compare binding mode of two of the most promising clones. Hit binder, D5, was selected and was immobilised onto an aldehyde-activated support. The adsorbent showed superior performance in binding Fab at basic pH and was able to efficiently isolate Fab from complex mixtures and to remove unwanted impurities. Overall, the approaches explored throughout this work contribute significantly to the rational design of affinity ligands for immunoglobulins and can pave the way for alternative cost-efficient purification strategies.Um dos principais focos de desenvolvimento e investigação na indústria biofarmacêutica é em anticorpos monoclonais (mAb). Além dos mAb, o setor verifica atualmente o desenvolvimento de outros formatos moleculares de anticorpos, como os fragmentos Fab e derivados. Apesar desta diversificação no reportório de anticorpos, as estratégias de purificação permanecem estagnadas, atuando somente sobre a purificação de mAb. Esta tese foca-se no desenvolvimento de novos ligandos de afinidade para purificação de mAb, Fab e outros anticorpos de origem não-humana. Uma abordagem sintética foi testada ao usar como inspiração uma biblioteca Petasis-Ugi. A existência de ligandos potencialmente promissores na biblioteca foi avaliada pela ligação a imunoglobulina humana G (IgG). Nesta triagem, B1Al2A2 foi selecionado como candidato principal, mostrando uma especificidade abrangente para a purificação de IgG, Fab, nanocorpos e immunoglobulina Y, a partir de misturas complexas. Estes resultados permitiram a criação de uma plataforma de purificação para diversos tipos de anticorpos que obteve altas purezas e rendimentos sob condições menos restringentes de eluição. Uma estratégia diferente, que envolveu bibliotecas combinatoriais biológicas usando um domínio artificial proteico, também foi testada. A biblioteca foi testada contra IgG, revelando o ligando E6 alta afinidade para anticorpos. O ligando foi expresso biologicamente em Escherichia coli, purificado e caracterizado, exibindo uma afinidade sub-micromolar, 154nM, para IgG. Impulsionados por estes resultados, a biblioteca foi novamente testada para obter um ligando para Fab. Neste sentido, um esquema de depleção foi desenhado para minimizar a existência de ligandos não-específicos ao incluir passos de seleção negativa com impurezas semelhantes a Fab. Estudos computacionais foram também realizados para comparação dos mecanismos de ligação de dois dos ligandos mais promissores. O candidato selecionado, D5, foi imobilizado num suporte sólido funcionalizado com aldeído. O adsorvente mostrou um bom desempenho ao ligar Fab a pH’s básicos, foi capaz de ligar e eluir Fab a partir de misturas complexas, assim como em remover impurezas indesejadas. De modo geral, as abordagens exploradas neste trabalho contribuem significativamente para o design racional de ligandos de afinidade para imunoglobulinas e pode ajudar a desbravar caminho para novas estratégias de purificação alternativas e eficientes