Caracterização morfológica e molecular de mosquitos afrotropicais, potenciais vetores de arbovírus

Muitas das espécies de mosquitos (Diptera: Culicidae) são vetores de patógenos responsáveis por doenças que constituem sérios problemas de saúde pública. Para o estudo da epidemiologia destas, e implementação de estratégias de controlo de vetores, é necessário o reconhecimento correto das espécies de mosquitos. Muitas destas, só são identificáveis com segurança, através de características da genitália dos machos; acresce que muitos espécimes coletados no campo tendem a danificar-se quer no processo de colheita ou de transporte até ao laboratório, perdendo caracteres de identificação importantes. Por outro lado, a integração dos métodos de identificação morfológica com o estudo de marcadores moleculares, será a melhor abordagem para a caracterização de espécies. O objetivo deste estudo foi caracterizar morfologicamente mosquitos Afrotropicais da subfamília Culicinae, nomeadamente através da genitália, bem como através do marcador barcode do gene mitocondrial CoxI, para uma identificação complementar e um estudo filogenético pelos métodos de máxima verosimilhança e Bayesiana. Além disso para o complexo pipiens usou-se o gene ACE2 para diferenciar Cx. pipiens e Cx. quinquefasciatus, e amplificou-se a região flanqueadora do microssatélite CQ11 de espécimes Cx. pipiens para diferenciar os ecotipos pipiens e molestus. Resultados: foram analisados 800 mosquitos, 652 (81,5 %) machos e 148 (18,5 %) fêmeas, de 67 espécies, tendo-se dissecado as genitálias de mosquitos machos, e algumas fêmeas, permitindo a correta identificação de 663 exemplares, 652 (98,3 %) machos e 11 (1,7 %) fêmeas, de 55 espécies de 9 géneros, Aedeomyia, Aedes, Coquillettidia, Culex, Eretmapodites, Ficalbia, Lutzia, Mansonia, Mimomyia e Uranotania. Obtiveram-se 247 sequências do gene CoxI de 65 espécies, das quais, as de Ae. capensis, Ae. mucidus, Cx. andersoni, Cx. telesilla, Cx. inconspicuosus, Er. subsimplicipes, Er. quinquevittatus, Fi. uniformis, Mi. hispida, Ur. alboabdominalis e Ur. mashonaensis, tanto quanto sabemos, foram obtidas pela primeira vez. A análise filogenética sugere que, Ad. africana apresenta duas populações na região Afrotropical; no género Aedes os subgéneros: Neomelaniconion, Stegomyia, Catageiomyia, Fredwardsius, Ochlerotatus e Mucidus formaram clados monofiléticos, enquanto os subgéneros Diceromyia, Aedimorphus e Albuginosus não, no entanto, os dois últimos formaram grupos informais; no género Culex, os subgéneros Eumelanomyia, Oculomyia e Culiciomyia formaram clados monofiléticos, no entanto, o subgénero Culex organizou-se em grupos informais, sem formar um clado monofilético; o género Lutzia formou um clado monofilético inserido dentro do género Culex; reportamos pela primeira vez, os ecotipos molestus e pipiens, e híbridos mol-pip na África do Sul; no género Mansonia, a população de Ma. uniformis, da região Afrotropical diverge da região Indomalaya; as espécies dos géneros: Eretmapodites, Coquillettidia, Ficalbia, Mimomyia e Uranotaenia agruparam-se de acordo com a sistemática. Pensamos ter contribuído para corrigir a falta de confirmação diagnosticante de sequências depositadas nas bases de dados, ao associar neste estudo quer a identificação morfológica, quer a identificação através da genitália, com as sequências respetivas do marcador CoxI. Contudo, este revelou-se insuficiente para separar complexos, e alguns grupos, de espécies, nomeadamente, Ae. simpsoni, Ae. mcintoshi, Cx. bitaeniorhynchus, Cx. simpsoni/sinaiticus, e Cx. pipiens, sendo necessários mais estudos com outros marcadores.Many mosquito species (Diptera: Culicidae) are vectors of pathogens responsible for diseases that constitute serious public health problems. For the study of their epidemiology, and implementation of vector control strategies, it is necessary to correctly recognize the species of mosquitoes. Many of these, are only reliably identified through features of male genitalia; in addition, many specimens collected in the field tend to be damaged either in the process of collection or transport to the laboratory, losing important identification characters. On the other hand, the integration of morphological identification methods with the study of molecular markers will be the best approach for species characterization. The aim of this study was to morphologically characterize Afrotropical mosquitoes of the Culicinae subfamily, namely through the genitalia, as well as through the barcode marker of the CoxI mitochondrial gene, for a complementary identification and a phylogenetic study by the maximum likelihood and Bayesian methods. In the pipiens complex, the ACE2 gene was used to differentiate Cx. pipiens and Cx. quinquefasciatus, and the flanquing region of the microsatellite CQ11 specimens was amplified to differentiate the pipiens and molestus ecotypes of Cx. pipiens. Results: 800 mosquitoes were analyzed, 652 (81.5%) males and 148 (18.5%) females, of 67 species, and the genitalia of male and some female mosquitoes were dissected, allowing the correct identification of 663 specimens, 648 (98.3%) males and 11 (1.7%) females, from 55 species of 9 genera, Aedeomyia, Aedes, Coquillettidia, Culex, Eretmapodites, Ficalbia, Lutzia, Mansonia, Mimomyia and Uranotania. 247 sequences of the CoxI gene from 65 species were obtained, of which those of Ae. capensis, Ae. mucidus, Cx. andersoni, Cx. telesilla, Cx. inconspicuosus, Er. subsimplicipes, Er. quinquevittatus, Fi. uniformis, Mi. hispida, Ur. alboabdominalis and Ur. mashonaensis, to the best of our knowledge, were obtained for the first time. Phylogenetic analysis suggests that Ad. africana has two populations in the Afrotropical region; in the genus Aedes the subgenera: Neomelaniconion, Stegomyia, Catageiomyia, Fredwardsius, Ochlerotatus and Mucidus formed monophyletic clades, while the subgenera Diceromyia, Aedimorphus and Albuginosus did not, however, the last two formed informal groups; in the genus Culex, the subgenus Eumelanomyia, Oculomyia and Culiciomyia formed monophyletic clades, however, the subgenus Culex organized into informal groups, failing to form a monophyletic clade; the genus Lutzia formed a monophyletic clade within the genus Culex; we report for the first time, the molestus and pipiens ecotypes, and mol-pip hybrids in South Africa; in the genus Mansonia, the population of Ma. uniformis, from the Afrotropical region diverges from the Indomalaya region; the species of the genera: Eretmapodites, Coquillettidia, Ficalbia, Mimomyia and Uranotaenia were grouped according to systematics. We believe to have contributed to improve the lack of diagnostic confirmation of sequences deposited in the databases, by associating in this study both morphological identification and confirmation through the genitalia, with the respective sequences of the CoxI marker. However, it was insufficient to separate complexes, and some groups, of species, namely, Ae. simpsoni, Ae. mcintoshi, Cx. bitaeniorhynchus, Cx. simpsoni/sinaiticus, and Cx. pipiens, therefore, further studies with other markers are needed