Populações linfocitárias no diagnóstico da Síndrome de Sjögren

A Síndrome de Sjögren primária (SSP) é uma doença inflamatória crónica, de origem autoimune, que se carateriza pela infiltração linfocitária e lesão das glândulas exócrinas.O diagnóstico diferencial entre uma síndrome seca de origem autoimune (SSP) ou não-autoimune (complexo Sicca) é o principal desafio no diagnóstico da SSP, tendo extrema importância no prognóstico e na terapêutica.Atualmente, os principais elementos para confirmar o componente autoimune da SSP são a presença de anticorpos anti-SSA e anti-SSB e de infiltrados linfocitários focais na biópsia de glândula salivar minor(labial). São desejáveis novos biomarcadores que traduzam a disfunção imune presente na SSP, pois nem sempre é fácil confirmar o diagnóstico, sobretudo nas fases precoces da doençaA hiperatividade das células B, suportada por células T, é responsável por algumas das caraterísticas clínicas e imunológicas mais reconhecíveis da doença, sendo sugerido na literatura que a avaliação de perfisde linfócitos específicos podeconstituir um elemento auxiliar no diagnóstico da SSP.A partir destes pressupostos, este trabalho teve como objetivo principal explorar das subpopulações linfocitárias (caraterizadas por citometria de fluxo), e a sua utilização como biomarcadores auxiliares no diagnóstico e classificação da SSP. Explorámos também a distribuição das subpopulações linfocitárias com os seguintes objetivos secundários: avaliar a sua relação com o status serológico da infeção pelo vírus Epstein-Barr (EBV); avaliar a sua relação com o perfil serológico (anti-SSA) e eventual associação a caraterísticas fenotípicas da SSP; avaliar a relação da morfologia do plexo nervoso corneano sub-basal, quer com o perfil linfocitário, quer com a atividade da doença na SSP.Para este efeito, foram incluídos 57 doentes com SSP classificados de acordo com os critérios do American-European Consensus Group(AECG ) (Vitali C, Bombardieri S, Jonsson R, Moutsopoulos HM et al. 2002), 68 doentes com síndrome Sicca sem critérios de SSP, 20 doentes com Artrite Reumatoide (AR) e 24 indivíduos saudáveis, sem queixas secas.A citometria de fluxo foi a metodologia utilizada na avaliação imunofenotípica das populações celulares, considerando também os ensaios funcionais, utilizados para a avaliação da produção de citocinas. Na abordagem dos níveis séricos de anticorpos, em particular no contexto da infeção por EBV, recorreu-se a ensaios imunoenzimáticos clássicos.Resumidamente, a avaliação imunofenotípica implicou a incubação de sangue periférico com um painel pré-validado de anticorpos monoclonais, otimizado para a caraterização de células T (incluindo várias subpopulações dentro das células T CD4 e T CD8, tais como células reguladoras e células foliculares), e de células B (assegurando a caraterização de diferentes estadios desdeas células de transição a células de memória e plasmablastos, ou células reguladoras, através de estratégias distintas como a classificação Bm1-5, frequentemente aplicada neste contexto). Foi ainda estudada a capacidade de as células T secretarem citocinas como a IL-17 e a IL-21, após estimulação com PMA e ionomicina. O painel de anticorpos monoclonais incluiu os seguintes marcadores: CD3, CD4, CD8, CD19, CD24, CD25, CD27, CD38, CD45, CD45RA, CCR6, CCR7, CXCR3, CXCR5, anti-IgD, anti-IgM. Por fim, para a obtenção de contagens absolutas, utilizou-se uma estratégia de plataforma única, com a utilização de tubos TruCountTM, com esferas calibradas.A aquisição das amostras foi efetuada num citómetro BD FACS CaliburTM(BD Biosciences, San Jose, CA, EUA), equipado com dois lasers, permitindo a avaliação de quatro fluorescências distintas. O software de aquisição foi o MultiSetTM(BD Biosciences), e para efeitos de análise, foram usados ainda os softwares Cell Quest 3.3TM(BD Biosciences) e InfynicytTM(Cytognos, Salamanca, Espanha). A análise estatística utilizou o programa Graph Pad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).Em linha com a literatura, no nosso estudo, a classificação clássica IgD/CD27 verificou a existência de uma redução dos números absolutos e percentagens de células B de memória (sobretudo sem switch) e aumento das células B naïve em doentes com SSP. A avaliação das células B de acordo com a classificação Bm1-Bm5 confirmou também o aumento das subpopulações Bm2 e Bm2 ́, e a diminuição das eBm5 e Bm5. Na razão entre as células Bm2+Bm2' e as eBm5+Bm5 foi possível aplicar cut-offs na discriminação entre SSP e controlos, ainda que com menor sensibilidade e especificidade em relação aos anteriormente descritos.Ainda assim, doentes com SSP com valores mais baixos células B de memória apresentavam maior frequência de caraterísticas fenotípicas da doença, como FS≥1, anticorpos anti-SSA, anticorpos anti-SSB, ANA e FR, e aumento das imunoglobulinas. Estes resultados, que se associam a menores valores de células B de memória e à disfunção autoimune na SSP estão de acordo com a hipótese de que a diferenciação das células B periféricas que migram para as glândulas salivares favorecem a formação de plasmócitos e a consequente produção de autoanticorpos.Verificámos também que os doentes Sicca apresentaram percentagens de células B naïve e de memória semelhantes às de doentes com SSP, e distintas das dos controlos, enquanto que os valores absolutos destas populações foram superiores aos da SSP, mas inferiores aos controlos. Considerando o desafio diagnóstico dos doentes Sicca, o seu perfil linfocitário intermédio entre SSP e controlos, evidente nos doentes Sicca, sugere a presença de disfunção imunológica, podendo alguns deles corresponder a formas ligeiras ou precoces de SSP.As células T foliculares efectoras (Tfh) têm um importante papel na patogénese da SSP, onde foi descrito um aumento das células Tfh circulantes e uma expansão da sua diferenciação nas GS (Li et al. 2012; Szabo et al. 2013). Ora, a marcada expansão de células Tfh e a simultânea presença de células Tfc nas glândulas salivares na SSP pode relacionar-se com mecanismos de resposta a um agente infecioso sialotrópico, como o EBV. Neste estudo, apesar dos números absolutos de células T CXCR5+estarem diminuídos na SSP, encontrámos um aumento das células T produtoras de IL-21, quer CD4+(Tfh), quer CD8+(Tfc). Além disso, as células Tfc estavam aumentadas nos doentes com SSP com maior atividade da doença, tendo sido possível identificar uma correlação positiva entre os números absolutos de células T IL21+CD8+e o ESSDAI, sugerindo um papel destas células na patogénese da doença. Curiosamente, o aumento das células T produtoras de IL-21 lembra o perfil de uma infeção viral crónica, e de facto, em relação aos marcadores serológicos de EBV, os doentes com SSP apresentaram maior prevalência de anti-EBV EA-D IgG, em comparação com doentes com AR e controlos saudáveis.Reconhecendo este aumento de prevalência de anti-EBV EA-D IgG e uma prevalência importante de anti-EBNA IgG em SSP, subdividimos estesdoentes em 3 grupos de acordo com o padrão serológico para EBV. Doentes com serologia positiva para EBV apresentavam ESSDAI superior ao de doentes sem evidência de infeção (G3). Em doentes com perfil serológico de infeção recente/reativação de EBV, a frequência de doentes com PSS ativa era também tendencionalmente superior à dos doentes com infeção antiga. Do ponto de vista celular também se verificaram alterações, com os doentes com evidência de infeção por EBV, em especial infeção recente/reativação, a apresentarem maior representação das subpopulações T pro-inflamatórias Th1 e Tfh1, o que pode indicar a influência viral na diferenciação preferencial destas células. Adicionalmente, doentes com infeção por EBV recente/reativação apresentavam níveis superiores de células B de transição e de plasmablastos, o que pode indicar a influência do EBV na modulação das respostas imunes na SSP e na expressão clínica, conforme sugerido pela manifestação mais precoce da doença e maior frequência de doença ativa nestes indivíduos...