RAC1B alternative splicing regulation in colorectal cancer cells

Dissertação de Mestrado em Biologia Molecular e Genética apresentado à Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2021Dissertação defendida em 26/2/2021Orientadores: Doutora Vânia Gonçalves (orientação externa); Doutor Peter Jordan (orientação interna)Trabalho desenvolvido no INSA no grupo de oncobiologia e vias de sinalização da UID do DGHColorectal cancer (CRC) is a common malignancy with significant mortality, which presents different subtypes due to genetic heterogeneity. The focus of this work was on a subtype that is characterized by microsatellite instability and mutations in the BRAF gene, being associated, in most cases, with RAC1B overexpression. RAC1B is a splicing variant of the RAC1 gene and is characterized by the inclusion of an additional exon through alternative splicing, designated as exon 3b, presenting some regulation and signalling differences when compared to RAC1. RAC1B has been described as a promoter of tumour progression, therefore, it is considered as a potential therapeutic target, as it may allow the design of targeted therapies for patients with this subtype of CRC, but for this, understanding in more detail the mechanisms of RAC1B regulation is extremely important. Previous research projects in the host lab had already identified SRSF1 and SRSF3 as two splicing factors involved in the regulation of RAC1B splicing in CRC, so the first goal of this thesis work was to determine the effect of other selected proteins on the expression of RAC1B in colorectal cell lines. The proteins of interest are a nucleoporin, RANBP2, and four splicing factors, PTBP1, ESRP1, DIS3L2 and hnRNP U, which were previously described as upregulated in CRC or involved in the RAC1B splicing process in other cell lines. The effect of these proteins on RAC1B alternative splicing was assessed through their overexpression and depletion in two colorectal cell lines, NCM460 and HT29, and the analysis of RAC1 exon 3b inclusion was made at the transcript level by RT-PCR, and at the protein level through SDS-PAGE and Western blot. The obtained results provided strong evidence that, in fact, these proteins influence RAC1B expression, both at the transcript and protein level. Although the overexpression experiments performed in this work did not lead to many clear conclusions about the effect of the proteins of interest on the RAC1B expression, the siRNA assays were rather conclusive. Taking into account the results obtained through depletion experiments, RANBP2 seems to act as a RAC1B inhibitor in NCM460 cells, while PTBP1, ESRP1, DIS3L2 and hnRNP U are probably enhancers of that RAC1 isoform. In the HT29 cell line, RANBP2 and DIS3L2 were pointed as inhibitors of exon 3b inclusion, while PTBP1, ESRP1 and hnRNP U are most likely enhancers of that alternative splicing event. The second goal of this work was to identify PTBP1 and ESRP1 RNA-binding motifs in the RAC1 transcript sequence. Here, two predicted ESRP1 binding motifs in the RAC1 transcript were identified and mutated in a RAC1 minigene, in order to verify if any of these changes could avoid ESRP1 binding and consequently affect the splicing process. The presence of the mutations was confirmed through DNA sequencing, however, it was not possible in the remaining time to reclone the mutant fragments into the original minigene vector, to assure they did not have undesired mutations, allowing to proceed to the planned experiments. Future studies should be performed in order to confirm the obtained results, as not all of them resulted in statistically significant variations on RAC1B expression levels, and it is also imperative to clarify how the nucleoporin RANBP2 affects RAC1B expression and what binding sites are recognized by the studied splicing factors in the RAC1 pre-mRNA.Em todo o mundo, são diagnosticados anualmente 1.8 milhões de casos de cancro colorretal, uma doença consideravelmente heterogénea e em muitos casos fatal. Este tipo de cancro divide-se em vários subgrupos sendo que um deles se caracteriza pela instabilidade de microssatélites, localização do tumor no cólon proximal, pólipos com morfologia serreada, metilação frequente de ilhas CpG, mutações no gene BRAF e sobreexpressão de RAC1B. A expressão de RAC1B resulta de um processo de splicing alternativo do gene RAC1, uma pequena GTPase com um papel importante no controlo de várias vias de sinalização celular. A existência de vários locais de splicing nos pré-mRNAs permite a existência de processos de splicing alternativo para além do constitutivo, ou seja, a partir do mesmo mRNA percursor, diferentes exões ou intrões podem ser incluídos ou excluídos do mRNA final, levando, por exemplo, à produção de diferentes isoformas de determinada proteína. Este mecanismo envolve as sequências consenso que são reconhecidas pela maquinaria de splicing, mas também a ação de proteínas trans que interagem com elementos cis presentes no RNA, atuando como repressoras ou ativadoras para os diversos tipos de splicing alternativo. A variante RAC1B resulta da inclusão de um exão alternativo no mRNA maduro do gene RAC1. Este denomina-se exão 3b, possui 57 nucleótidos que se traduzem em 19 aminoácidos adicionais na proteína resultante, e confere a esta variante diferentes propriedades relativamente a sinalização celular. A regulação da proteína RAC1 é feita através de vários fatores que modulam o seu estado de ativação pela ligação a GTP ou GDP e que, consequentemente, afetam a sua localização e atividade. Sabe-se que a regulação de RAC1B é semelhante, mas esta isoforma tem uma menor afinidade para GDP, menor capacidade de hidrolisar GTP e incapacidade para interagir com inibidores de dissociação de GDP, o que resulta numa predominância desta proteína nas células na sua forma ativa. Apesar de o processo de splicing alternativo ser comum a todas as células, a sua desregulação está muitas vezes associada ao desenvolvimento de doenças. A sobreexpressão de RAC1B, para além de associada a este subtipo de cancro colorretal onde promove a sobrevivência das células tumorais e a sua progressão no ciclo celular, foi também identificada em cancro pancreático, da mama, do pulmão e da tiroide. Esta proteína poderá então ser um alvo terapêutico para o tratamento de pacientes com algumas formas de cancro, o que enaltece a importância do estudo da sua regulação nas células humanas. Tendo em conta que os processos de splicing são modulados por diferentes proteínas, é importante identificar e descrever aquelas que influenciam a expressão de RAC1B neste contexto. Os fatores SRSF1 e SRSF3 foram previamente descritos na literatura como moduladores do splicing de RAC1B em cancro colorretal, uma vez que SRSF1 promove a inclusão do exão 3b e SRSF3 promove a sua exclusão. Foram também identificadas regiões no pré-mRNA do gene RAC1 que são necessárias à ligação destes fatores, o que permitiu conhecer melhor os mecanismos de regulação deste processo. Mais recentemente, várias outras proteínas têm sido descritas como sobreexpressas em diferentes tipos de cancro, bem como capazes de influenciar a expressão de RAC1B em vários tipos de células. Para este trabalho as proteínas RANBP2, PTBP1, ESRP1, DIS3L2 e hnRNP U foram selecionadas como objeto de estudo, sendo o primeiro objetivo deste trabalho a descrição da sua influência na inclusão ou exclusão do exão 3b de RAC1 em células colorretais. Com esta finalidade, procedeu-se a experiências de sobreexpressão destas proteínas, mas também à depleção da sua expressão endógena em duas linhas celulares colorretais, uma não tumorigénica (NCM460) e uma maligna com sobreexpressão de RAC1B (HT29). Os efeitos das referidas experiências foram verificados através de RT-PCR e Western blot, quantificando-se a expressão de RAC1B relativamente à expressão de RAC1 em cada uma das condições. A depleção da nucleoporina RANBP2 levou a um aumento da expressão de RAC1B relativamente a RAC1 em células NCM460, tanto ao nível do RNA como da proteína, tendo-se verificado também este aumento em células HT29, mas apenas em relação a expressão proteica. Estes resultados indicam que a RANBP2 provavelmente atua como inibidora da inclusão do exão 3b em RAC1. Contudo, não foi possível confirmar estas observações através das experiências de sobreexpressão, visto que esta não teve efeitos significativos na expressão de RAC1B, excetuando em NCM460 onde levou a um aumento ao nível da proteína, o que contradiz os resultados acima descritos. A sobreexpressão dos quatro fatores de splicing em estudo não permitiu retirar conclusões acerca do seu efeito na inclusão ou exclusão do exão 3b no mRNA maduro do gene RAC1, contudo as experiências de depleção tiveram maior sucesso. Relativamente a PTBP1, a sua depleção provocou uma diminuição da expressão de RAC1B relativamente a RAC1 em ambas as linhas celulares utilizadas, detetável tanto por RT-PCR como por Western blot, indicando que esta proteína atua como promotora da inclusão do exão 3b de RAC1. Para o fator de splicing ESRP1, após depleção em células NCM460 houve também diminuição dos níveis de RAC1B relativamente a RAC1 ao nível do transcrito. Tanto ao nível da proteína em NCM460, como nas mesmas experiências em HT29, os resultados obtidos mostraram seguir a tendência de diminuição da inclusão do exão 3b, contudo, não foram considerados estatisticamente significativos. Concluiu-se então que este fator possivelmente também atua como promotor de RAC1B. Em relação a DIS3L2, em NCM460, apesar de os resultados não serem estatisticamente significativos, verifica-se uma tendência para a diminuição da expressão de RAC1B, enquanto que em HT29 há um aumento significativo da expressão desta variante ao nível da proteína, sendo que ao nível do transcrito, apesar de haver uma variação menor, se confirma esta tendência. Neste caso, a DIS3L2 parece promover a inclusão do exão alternativo 3b em células NCM460, mas inibi-lo em células HT29. Finalmente, a depleção de hnRNP U levou a uma diminuição da expressão de RAC1B relativamente a RAC1 em ambas as linhas celulares, não sendo estatisticamente significativo apenas o resultado ao nível da proteína em NCM460, indicando que hnRNP U atua como promotor da expressão de RAC1B. O segundo objetivo deste trabalho consistia na identificação de locais de ligação dos fatores PTBP1 e ESRP1 ao pré-mRNA do gene RAC1. Para isto, procedeu-se à mutagénese de dois possíveis locais de ligação da proteína ESRP1, previamente descritos na literatura, num minigene contendo a região entre os exões 3 e 4 do gene em questão. A mutação dos locais pretendidos no intrão 3b do minigene foi confirmada através de sequenciação do DNA, mas não foi possível proceder à subclonagem dos fragmentos mutados no minigene original, de modo a prevenir a introdução de mutações indesejadas. No futuro deve proceder-se da mesma forma na introdução de mutações em possíveis locais de ligação do fator PTBP1, e poderá sequenciar-se os plasmídeos mutados, como estratégia alternativa à subclonagem, sendo que cada minigene mutado pode depois ser transfetado juntamente com o fator em estudo, ESRP1 ou PTBP1, de modo a investigar se a expressão de RAC1B nas células se altera em relação à transfeção de um minigene não mutado juntamente com o mesmo fator. Concluindo, com este trabalho foi possível demonstrar que as proteínas RANBP2, PTBP1, ESRP1, DIS3L2 e hnRNP U estão envolvidas na regulação do splicing alternativo de RAC1 em células colorretais. Resultados preliminares indicam que RANBP2 inibe a inclusão do exão 3b em RAC1, enquanto que PTBP1, ESRP1 e hnRNP U promovem a sua inclusão. Relativamente ao fator de splicing DIS3L2, parece ter diferentes efeitos dependendo da linha celular utilizada, podendo promover ou inibir a expressão de RAC1B. Estudos futuros deverão ser realizados, de modo a consolidar estes resultados, esclarecer as vias moleculares através das quais a nucleoporina RANBP2 afeta a expressão de RAC1B e definir locais de ligação dos fatores de splicing em estudo, no pré-mRNA do gene RAC1. Estes conhecimentos poderão ser úteis para o desenvolvimento de novas terapias para pacientes com este subtipo de cancro colorretal, que inibam especificamente as vias que afetam a inclusão do exão 3b, de modo a restaurar a normalidade da sinalização celular.This work was supported by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, through Grant PTDC/BIA-MOL/28386/2017 to Vânia Gonçalves.N/