L'inibizione dell'enzima NAAA blocca la replicazione di ZIKV in cellule neuroepiteliali umane.

Zika (ZIKV) è un virus a singolo filamento di RNA a polarità positiva (+ssRNA), appartenente alla famiglia Flaviviridae. L’infezione viene trasmessa tramite la puntura di una zanzara infetta del genere Aedes o mediante trasmissione verticale dalla madre al feto durante la gravidanza. Il meccanismo di entrata di Z IKV all’interno della cellula avviene esclusivamente per endocitosi. In seguito all’infezione si attiva una violenta risposta infiammatoria che può causare danno alle cellule nervose con gravi conseguenze neurologiche nell’adulto, come la sindrome di Giuillain-Barrè, e casi di microcefalia neonatale. Ad oggi non sono disponibili vaccini o terapie specifiche nel trattamento dell’infezione dal virus Zika. Nel nostro laboratorio sono stati condotti studi preliminari su due linee modello per le infezioni virali, le A549 e le Huh-7, grazie ai quali è stato possibile analizzare come l’inibizione farmacologica di un enzima coinvolto nel metabolismo energetico, la N-acylethanolamine acid amide hydrolase (NAAA), influenzi la replicazione di ZIKV modulando al contempo anche la risposta infiammatoria tramite l’accumulo di un lipide endogeno dalle spiccate proprietà antinfiammatorie, la palmitoiletanolammide (PEA). La NAAA appartiene alla famiglia delle choloyglycine hydrolase ed il suo ruolo è quello di idrolizzare etanolammidi, mostrando specificità di substrato per la PEA, una molecola con elevata attività antinfiammatoria, neuroprotettiva ed analgesica. Un accumulo dei livelli intracellulari della PEA potrebbe pertanto contrastare la forte risposta infiammatoria che si scatena a seguito dell’infezione virale. Tuttavia, finora, non era chiaro se l’inibizione dell’enzima potesse anche avere ripercussioni sulla replicazione virale. NAAA è abbondantemente espressa nelle cellule del sistema nervoso centrale e in quelle del sistema immunitario. L’enzima localizza nelle vescicole endosomiali a pH acido, le stesse dove avvengono anche i processi di assemblaggio di ZIKV. Lo scopo di questo elaborato di tesi è quello di valutare come inibitori farmacologici della NAAA possano modulare il processo autofagico, la vitalità cellulare e la replicazione virale in cellule neuroepiteliali staminali umane derivate da neocorteccia (NES-NCX) che rappresentano il naturale bersaglio di ZIKV. Dai dati finora ottenuti è stato possibile osservare una diminuzione della carica virale sia nei surnatanti di NES-NCX infettate da ZIKV che a livello cellulare in campioni trattati con inibitori di NAAA, rispetto alle sole cellule infettate. Inoltre, analisi microscopio confocale high-content dimostrano un aumento del processo autofagico nelle cellule che hanno subito il trattamento, anche durante l’infezione da ZIKV. L‘incremento autofagico indotto dall’inibizione della NAAA contrasta l’azione soppressiva esercitata da ZIKV sul processo autofagico e potrebbe essere responsabile, in parte, della diminuzione della replicazione virale osservata. Questi risultati potranno fornire nuove prospettive terapeutiche per il trattamento intrauterino dell’infezione e per contrastare la neuroinfiammazione causata dalla replicazione di ZIKV nell’adulto. Zika (ZIKV) is a single-stranded positive polarity RNA (+ssRNA) virus, belonging to the Flaviviridae family. The infection is transmitted by the bite of an infected mosquito of the genus Aedes or by vertical transmission from mother to fetus during pregnancy. The mechanism of entry of Z IKV into the cell is exclusively by endocytosis. Following infection, a violent inflammatory response is triggered that can cause damage to nerve cells with serious neurological consequences in adults, such as Giuillain-Barré syndrome, and cases of neonatal microcephaly. To date there are no vaccines or specific therapies available in the treatment of Zika virus infection. In our laboratory, preliminary studies have been conducted on two model lines for viral infections, A549 and Huh-7, thanks to which it was possible to analyze how the pharmacological inhibition of an enzyme involved in energy metabolism, the N-acylethanolamine acid amide hydrolase (NAAA), affects the replication of ZIKV while also modulating the inflammatory response through the accumulation of an endogenous lipid with strong anti-inflammatory properties, palmitoylethanolamide (PEA). The NAAA belongs to the family of choloyglycine hydrolase and its role is to hydrolyze ethanolamides, showing substrate specificity for PEA, a molecule with high anti-inflammatory, neuroprotective and analgesic activity. An accumulation of intracellular levels of PEA could therefore counteract the strong inflammatory response that is triggered following viral infection. However, until now, it was unclear whether inhibition of the enzyme could also affect viral replication. NAAA is abundantly expressed in cells of the central nervous system and in those of the immune system. The enzyme localizes to acidic pH endosomal vesicles, the same ones where ZIKV assembly processes also occur. The aim of this thesis is to evaluate how pharmacological inhibitors of NAAA can modulate the autophagy process, cell viability and viral replication in human neocortex-derived neuroepithelial stem cells (NES-NCX) that represent the natural target of ZIKV. From the data obtained so far it was possible to observe a decrease in viral load both in supernatants of NES-NCX infected with ZIKV and at the cellular level in samples treated with NAAA inhibitors, compared to infected cells only. In addition, high-content confocal microscopy analysis demonstrates an increased autophagic process in the treated cells, even during ZIKV infection. The autophagic increase induced by NAAA inhibition counteracts the suppressive action exerted by ZIKV on the autophagic process and could be responsible, in part, for the observed decrease in viral replication. These results may provide new therapeutic perspectives for the intrauterine treatment of infection and to counteract neuroinflammation caused by ZIKV replication in adults