Protocol to remove the crioprotector from the cryopreserved milt from Rhamdia quelen

A criopreservação oferece vários benefícios, entre estes o armazenamento de espermatozoides a longo prazo. No entanto, a falta de padronização ou a redução da qualidade espermática após o congelamento-descongelamento são desafios que ainda precisam ser resolvidos. O uso de tecnologias de reprodução assistida, como a centrifugação, tem sido relatada como uma ferramenta que permite separar a melhor porção de espermatozoides do sêmen criopreservado. O objetivo da pesquisa foi desenvolver um método de centrifugação para sêmen criopreservado de Rhamdia quelen e sua influência sobre a funcionalidade e capacidade de fecundação dos espermatozoides separados por gradiente de densidades AllGrad® 90%. Para isto foram realizados dois estudos. O primeiro estudo teve como objetivo a padronização de um método de centrifugação por gradiente de densidades para a separação do sêmen criopreservado de R. quelen a través do gradiente AllGrad® 90%. Seguidamente o método foi validado por meio de análises de qualidade (concentração, motilidade e morfologia espermática). Ao final deste estudo, a centrifugação de 1000 x g por 10 min, permitiu obter em média 8,19 x 106 espermatozoides normais/mL (22,25 ± 4,64%). Este valor representa um aumento de 9,25% dos espermatozoides normais em comparação ao sêmen criopreservado não centrifugado (P = 0,0013). Esse resultado deu lugar a um segundo estudo, cujo objetivo foi validar a eficiência da técnica de centrifugação por gradiente de densidades sobre a funcionalidade espermática e capacidade de fertilização. Foram comparados três tratamentos: i) controle (sêmen descongelado não centrifugado), ii) a centrifugação diferencial ou peletização e, iii) centrifugação por gradiente de densidades com AllGrad® 90%. A centrifugação diferencial resultou em melhores taxas de motilidade (42,58 ± 6,05%). Tanto a centrifugação diferencial quanto por gradiente de densidades resultou em melhores índices de atividade mitocondrial (1,58 ± 0,79 e 2,02 ± 1,88 AU/100 milhões sptz, respectivamente), taxa de fertilização (76,68 ± 15,22% e 69,85 ± 17,85%, respectivamente) e de eclosão (54,62 ± 17,39% e 50,87 ± 20,59%, respectivamente). Portanto, os métodos de centrifugação aplicados pela primeira vez no sêmen criopreservado de R. quelen, mostraram ser eficientes para obter uma melhor fração de espermatozoides.Cryopreservation offers several benefits, including long-term storage of sperm. However, the lack of standardization or the reduction of sperm quality after freezing-thawing are challenges that still need to be solved. The use of assisted reproduction technologies, such as centrifugation, has been reported as a tool that allows the best portion of sperm to be separated from cryopreserved milt. The objective of the research was to develop a centrifugation method for cryopreserved milt from Rhamdia quelen and its influence on the functionality and fertilization capacity of spermatozoa separated by 90% AllGrad® density gradient. For this, two studies were carried out. The first study aimed to standardize a density gradient centrifugation method for the separation of R. quelen cryopreserved milt through the AllGrad® 90% gradient. Then the method was validated through quality analysis (concentration, motility and sperm morphology). At the end of this study, the centrifugation of 1000 x g for 10 min, allowed an average of 8.19 x 106 normal sperm/mL to be obtained (22.25 ± 4.64%). This value represents a 9.25% increase in normal sperm compared to non-centrifuged cryopreserved milt (P = 0.0013). This result gave rise to a second study, whose aim was to validate the efficiency of the density gradient centrifugation technique on sperm functionality and fertilization capacity. Three treatments were compared: i) control (non-centrifuged thawed semen), ii) differential centrifugation or pelletization, and iii) density gradient centrifugation with AllGrad® 90%. Differential centrifugation resulted in better motility rates (42.58 ± 6.05%). Both differential centrifugation and density gradient resulted in better rates of mitochondrial activity (1.58 ± 0.79 and 2.02 ± 1.88 AU/100 million sptz, respectively), fertilization rate (76.68 ± 15.22% and 69.85 ± 17.85%, respectively) and hatching (54.62 ± 17.39% and 50.87 ± 20.59%, respectively). Therefore, the centrifugation methods applied for the first time in the cryopreserved milt of R. quelen, proved to be efficient to obtain a better fraction of sperm