Assessment of the p53 transcriptional activity : a way to predict the clinical and therapeutic responses in superficial transitional cell carcinoma of the bladder and in head and neck squamous cell carcinoma

La protéine suppresseur de tumeur p53 est une nucléo-phosphoprotéine essentielle à la stabilité de l’ADN. Elle agit principalement comme un facteur transcriptionnel, capable de trans-activer ou –réprimer l’expression de nombreux gènes cibles, ceux-ci étant impliqués dans des voies métaboliques variées, dont notamment l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose. Actuellement, on estime qu’environ la moitié des cancers humains présente un p53 muté. Suite à ces mutations, la protéine p53 perd en général sa capacité à se fixer sur l’ADN, ce qui conduit à une résistance accrue à la radio- ou chimiothérapie. En conséquence, de nombreuses études ont essayé de déterminer la valeur prédictive clinique des mutations de p53 et/ou de sa surexpression. Cependant, étant donné le nombre de discordances rapportées dans la littérature ces dix dernières années, des études supplémentaires tentant d’établir une meilleure corrélation entre l’état du gène p53, les voies de réponse p53-dépendantes et l’évolution thérapeutique ou clinique semblent nécessaires. Le premier objectif de notre étude a été de déterminé l’état de la protéine p53 par une analyse fonctionnelle en levure (FASAY : functional analysis of separated alleles in yeast), ainsi que par une approche conventionnelle, l’immunohistochimie. Ces données ont ensuite été comparées et corrélées aux caractéristiques clinico-pathologiques et l’évolution clinique de patients présentant des tumeurs vésicales, ainsi qu’aux réponses cellulaires radio- et/ou chimio-induites de lignées cellulaires de la sphère ORL. Sur base de nos études ex vivo et in vitro, nous concluons que le FASAY présente de nombreux avantages, comparé à l’immunohistochimie ou autre analyse génotype. Le FASAY est une méthode de sélection rapide et reproductible. Elle permet une détection sensible et spécifique de mutants p53 transcriptionnellement inactifs tout en excluant les polymorphismes silencieux. De plus, un p53 non fonctionnel tel que déterminé par le FASAY a semblé être le meilleur marqueur prédictif de récurrence dans les tumeurs de la vessie, y compris dans le sous-groupe des tumeurs de stade a-1/grade 3, surpassant le stade ou grade tumoral ainsi que le marquage immunohistochimique. Un p53 non fonctionnel s’est également révélé être un marqueur prédictif fiable des réponses radio- et/ou chimio-induites dans les lignées cellulaires ORL. De façon intéressante, un effet antagoniste a été observé entre le docetaxel et l’irradiation pour chaque lignée cellulaire. Cet antagonisme semblait être influencé par l’état fonctionnel de p53, la lignée p53-sauvage montrant la plus importante réduction apoptotique. Il est à noter que cette combinaison pourrait avoir des conséquences nuisibles sur l’efficacité des thérapies cliniques. Le FASAY semble donc être un puissant test pour déterminer l’état de p53, lequel semble alors être une bonne valeur prédictive aussi bien pour l’évolution d’autres techniques, tels que les microdamiers à ADN qui permettront d’identifier des marqueurs biologiques prédictifs additionnels ainsi que d’investiguer les mécanismes moléculaires radiochimio-induits.Tumor suppressor p53 is a nuclear phosphoprotein essential for the DNA stability. It primarily acts as a transcriptional factor, able to trans-activate or -repress expression of multiple target genes. These downstream genes are implicated in various pathways, including the best-described cell-cycle arrest and apoptotic cell death. Currently, it is estimated than around half of all human cancers carry p53 mutations. These mutations generally induce a loss of binding to DNA and thus increased radiotherapy or chemotherapy resistance. Accordingly, multiple studies have attempted to assess the predictive value of detecting p53 mutations and/or overexpression in clinical settings. However, a large discrepancy reported over the last ten years justified repeated calls for a better correlation study between the p53 genetic status, p53 pathway and the therapeutic or clinical outcome. The first aim of our study was to determine the functional status of the p53 protein by a functional analysis of separated alleles in yeast (FASAY), as well as by a conventional approach, immunohistochemistry. These data were then compared and correlated with clinicopathologic features and the clinical outcome of bladder tumor, and also with radio- and/or chemo-induced cellular responses (cell cycle, apoptosis, gene expression) of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines. Based on our ex vivo and in vitro studies, we conclude that there are many advantages of FASAY compared to immunohistochemistry or genotypic analysis. FASAY is a rapid, reproducible and robust screening assay. It permits a sensitive and specific detection of transcriptionally inactive p53 mutants while ruling out biologically silent polymorphisms. Moreover, a nonfunctional p53 determined by FASAY seemed to be the strongest predictor of recurrence in bladder tumor, including the subgroup of stage a-1/grade 3, superseding tumor grade and stage as well as p53 immunohistochemistry staining. Nonfunctional p53 also seemed to be a reliable predictor of radio- and/or chemo-induced cellular responses of HNSCC cell lines. Interestingly, an antagonistic effect between docetaxel and radiation was found within each cell line. This antagonism appeared to be influenced by a functional p53, the p53 wild-type cell line showing the higher apoptotic decrease. Note that such a combination may have deleterious consequences on the clinical therapeutic efficiency. FASAY thus seems to be a powerful assay to determine the p53 status, which by this method appeared the best predictive value so far of the clinical outcome and therapeutic responses. It may now be associated to other techniques, such as DNA microarrays that will allow to identify additional predictive biological markers and to further investigate the radiochemotherapeutic-induced molecular mechanisms.Thèse de doctorat en sciences biomédicales (oncologie)(ONCO) -- UCL, 200