Molecular mechanisms of the translocation of Yersinia Yop proteins across the eukaryotic cell membrane

Le virulon Yop de Yersinia constitue le paradigme des systèmes de sécrétion-translocation de type III. Ce système de virulence consiste en l’injection de protéines bactériennes, appelées effecteurs, dans le cytosol des cellules de l’hôte en vue d’y modifier l’organisation au profit de la bactérie. L’injection de ces effecteurs comprend plusieurs étapes dont le passage au travers des membranes bactériennes, étape appelée sécrétion, et le passage au travers de la membrane de la cellule eucaryote, étape appelé translocation. Le but de cette thèse est de clarifier le mécanisme de la translocation des effecteurs injectés par Yersinia. Les protéines impliquées dans le processus de translocation sont codées par l’opéron IcrGlcrVsycDyopByopD. Leur rôle et leur organisation étaient inconnus au début de ce projet. L’existence d’un complexe dans le cytoplasme bactérien, constitué de YopB et de YopD, associés à leur chaperon SycD, a pu être démontrée par co-purification de protéines de fusion avec la glutathione-S-transférase (GST) et par co-immunoprécipitation du complexe. Dans un mutant IcrV non polaire, ce complexe n’est plus sécrété, ce qui suggère une interaction entre YopB, YopD et LcrV. En accord avec cette idée, la liaison entre LcrV et YopB, d’une part et entre LcrV et UopD d’autre part, a également pu être mise en évidence, à l’aide de protéines de fusion avec la GST. Nous proposons que, au moment de la sécrétion, SycD est relargué dans le cytoplasme bactérien et LcrV vient se lier au complexer YopB-YopD, promouvant ainsi sa sécrétion et son assemblage pour former l’appareil de translocation. Yersinia présente une activité hémolytique qui dépend de la protéine YopB suggérant que celle-ci est impliquée dans l’insertion d’un pore (Hakansson et al., 1996b). Vu que nos résultats montrent que YopB et YopD forment un complexe dans la bactérie, il était envisageable que YobD soit également impliqué dans la formation du pore. L’insertion de pores dans la membrane de macrohages a pu être démontrée par l’usage de marqueurs flourescents de différentes tailles et par l’observation de l’écrasement de cellules infectées par Yersinia. L’importance de YopB et YopD dna la formation des pores a pu être mise en évidence dans ce système en infectant les macrophages par des Yersinia mutées dans les gènes correspondants. Par contre une mutation dans LcrG n’affecte pas l’insertion du pore. Ces résultats ont été confirmés par des expériences d’hémolyse. La question de la formation du pore a également été étudiée par des techniques d’électrophysiologie en collaboration avec V. Cabiaux et F. Tardy (ULB). L’analyse de la conductance au travers de bicouches lipidiques artificielles infectées par Yersinia sauvage ou par des bactéries mutées a permis de mettre en évidence l’insertion d’un canal par les bactéries dans la membrane de liposomes. Ce phénomène requiert également YopB et YopD mais ne requiert pas LcrG. En annexe de ce travail, l’identification de gènes de résistance à l’arsenic sur un transposon, porté par le plasmide de virulence de Yersinia enterocolitica est présentéeThe Yersinia Yop virulon constitutes the paradigm of the type III secretion-translocation systems which are encountered in several animal and plant pathogens. This system allows the delivery of bacterial virulence factors, called effectors, into the cytosol of the eukaryotic cells of the host in order to modify their signalling pathways or their organization at the cells of the host in order to modify their signalling pathways or their organization at the benefit of the pathogen. Injection of these virulence factors involves several steps among which the crossing of the bacterial membrane, called secretion, and of the eukaryotic cell membrane, generally called translocation. The aim of this thesis was to clarify this translocation process. the proteins involved in the translocation process are encoded by a single operon, IcrGlcrVsycDyopByopD. At the start of this project, their role and their organization were unknown. Investigating the possible interactions between these proteins, using glutathione-S-transferase (GST) hybrid protein co-purification and co-immunoprecipitation experiments, allowed us to demonstrate the existence of a complex in the bacterial cytoplasm, constituted of YopB and YopD, associated with SycD. Mutation of IcrV abolished the secretion of the complex and GST hybrids pull down experiments showed that both, YopB and YopD, were capable of binding to LcrV. We propose that, at the moment of secretion, SycD is released and LcrV binds to YopB and YopD promoting their secretion and assembly into a translocation apparatus. Yersinia displays a YopB-dependent membrane disrupting activity on sheep erythrocytes, suggesting that YopB mediated pore formation (Hakasson et al., 1996b). Since our previous results indicated that YopB and YopD are associated in the bacterial cytoplasm, we wondered if the YopD protein would also be required for pore formation together with YopB. Pore formation in the macrophage cell membrane was first demonstrated by showing flattening and permeation to fluorescent dyes of cells infected by Yersinia. Infection of macrophages by yopB or yopD mutants, however, did not lead to pore formation indicating that YopD, as well as YopB, were required for the process. In contrast, mutation of IcrG did not affect the insertion of a pore. Requirement for YopD but not for LcrG was confirmed in a heamolysis assay. The question of pore formation, was also addressed using electrophysiological methods in collaboration with V. Cabiaux and F. Tardy (ULB). Conductance measurements realized on artificial bilayers infected by wild-type or mutant Yersinia provided evidence for the membrane insertion a channel by the bacteria. This phenomenon also required YopB, YopD but not LcrG. In annex of this work, the identification of arsenic, resistance genes on a transposon, carried by the virulence plasmid of Yersinia enterocolitica, is presentedThèse de doctorat en sciences biomédicales (patholgénie microbienne) -- UCL, 199