Hur mycket påverkar tvärbindningen porositeten i den kromatografiska stationära fasen?

Vätskekromatografi är vanligt förekommande metod för separationer av molekyler inom bioteknik. Det finns inom begreppet vätskekromatografi många olika tekniker och vilken specifik teknik som är mest lämplig för en given separation beror på egenskaperna hos den avsedda målmolekylen. Egenskaper för vilka målmolekyler kan separeras är bland annat storlek, laddning och affinitetsintreaktioner. Porositeten är i den stationära fasen en avgörande egenskap, eftersom porernas tillgänglighet påverkar den stationära fasens tillgängliga yta. Således är förmågan att bestämma porositeten en avgörande aspekt vid tillverkningen av den stationära fasen. Agaros utgör ofta den stationära fasen, på grund av modifieringsmöjligheterna hos polysackaridkedjorna. Bio-Works Workbeads 40/1000 SEC är agarbaserade pärlor för den stationär fas i storleksutslutningskromatografi. Pärlorna är tvärbundna två gånger för att få tillräcklig styvhet och för att uppnå en önskad fördelningskoefficient. Det första tvärbindningssteget bestämmer strukturen på pärlorna och därmed porositeten, medan det andra tvärbindningssteget försäkrar att pärlorna får tillräcklig styvhet. För produkten Workbeads 40/1000 är de önskade fördelningskoefficienterna mellan 0,2-0,35 för thyroglobulin, 0,62-0,75 för albumin (från äggvita) och 0,85-0,95 för ribonukleas A. För att bestämma förhållandet mellan koncentrationerna av reaktanterna NaOH och allylbromid i den första tvärbindningen och de resulterande egenskaperna hos den stationära fasen (fördelningskoefficienter, styvhet och porstorlek) ändrades koncentrationerna av reaktanterna i den första tvärbindningen. Samtliga resulterande pärlorna med de ändrade koncentrationerna analyserades med hjälp av en ÄKTAexplorer. Pärlornas styvhet bestämdes genom att analysera kraschflödet i den packade bädden. Det fanns inga tecken på några skillnader mellan de tillverkade pärlproverna. De icke-specifika interaktionerna analyserades genom att jämföra fördelningskoefficienterna i en standard PBS-buffert med en hög saltkoncentrationsbuffert. Polaritetsförändringen i den mobila fasen kan påverka de icke-specifika interaktionerna eftersom hydrofobiska interaktioner då främjas. Fördelningskoefficienternas kurvor jämfördes också för att analysera likheter och skillnader för olika proteiner. Skillnader i formen på fördelningskoefficientkurvorna kan innebära att porstorleken inte är den enda bidragsfaktorn till skillnaderna i fördelningskoefficienterna. Därför kan skillnaden innebära effekter av icke-specifika interaktioner och det fanns det indikationer på att vissa icke-specifika interaktioner uppstod mellan proteinerna och agarpärlorna. Det finns dock ingen skillnad mellan de pärlor med många tvärbindningar och de med få tvärbindningar. Porstorleken och porstorleksdistribution bestämdes genom att använda en uppsättning dextran med inverterad storleksutslutningskromatografi. Efter varje tvärbindningsreaktioner bestämdes antalet bildade tvärbindningar genom titrering med silvernitrat. Det visade sig att koncentrationen av allylbromid hade en större inverkan på de resulterande egenskaperna jämfört med koncentrationen av NaOH. En ökad koncentration av allylbromid visade på ett ökat antal bildade tvärbindningar. Experiment med många bildade tvärbindningar visade sig ha en större porstorlek och högre fördelningskoefficienten jämfört med experiment med lägre mängd bildade tvärbindningar.Liquid chromatography is a method that is extensively used for separations in biotechnology at present. There are many different techniques within the concept of liquid chromatography and which specific technique that is most suitable depends on the properties of the intended target molecule. Properties for which target molecules can be separated are among others, size, charge, and affinity interactions. The porosity is a crucial property of the chromatographic resin, as the accessibility of pores determines the accessible surface area of the resin. Thus, the ability to determine the porosity is a crucial aspect in the manufacturing of the resin. Agarose often constitutes the chromatographic resin, due to the modification possibilities of the polysaccharide chains. Bio-Works Workbeads 40/1000 SEC are agar-based size exclusion chromatography beads. The beads are cross-linked twice in order to obtain sufficient rigidity and to achieve a desired distribution coefficient. The first cross-linking step determines the structure of the beads thereby stets the porosity and the second cross-linking step ensures a sufficinet rigidity. For the product Workbeads 40/1000 the desired distribution coefficients is between 0.2-0.35 for thyroglobulin, 0.62-0.75 for albumin (from egg white) and 0.85-0.95 for ribonuclease A. To determine the relation between the concentrations of two reactants NaOH and allyl bromide in the first cross-linking step and the resulting properties of the resin (distribution coefficients, rigidity, and pore size), the concentrations in the first cross-linking were changed. All resulting beads with the altered reactant concentrations were analyzed using an ÄKTAexplorer. The rigidity of the beads was determined by analyzing the crash flow rate of the packed bed. There were no indications of any differences between the manufactured resin samples. The non-specific interaction was analyzed by comparing the distribution coefficients in a standard PBS buffer to a high salt concentration buffer. The polarity change in the mobile phase might affect the non-specific interactions since hydrophobic interactions would be promoted. The distribution coefficient curves were also compared for similarities and differences between different proteins. Differences in the shape of the distribution coefficient curves might imply that the pore size is not the only contribution factor to the distribution coefficient differences. Hence, the difference might imply the effect of non-specific interactions. It was indicated that some non-specific interactions occurred between the proteins and the agar beads. However, there was no difference between beads of varying cross-linking degree. The porosity and pore size distribution were determined by utilizing a set of dextran’s with Inverse Size Exclusion Chromatography (ISEC). After each cross-linking step the number of cross-links was determined by titration with silver nitrate (AgNO3). It was shown that the concentration of allyl bromide had a greater impact on the resulting properties compared to the concentration of NaOH. An increased concentration of allyl bromide showed increased number of formed cross-links. Experiments with many formed cross-links was shown to have a larger pore size and higher distribution coefficient Kd compared to experiments with lower amount of formed cross-links